淀粉糖化酶抗體的研制及其雙抗夾心ELISA法的初步建立與應(yīng)用.pdf

1、淀粉糖化酶(GA)能將淀粉轉(zhuǎn)化成低分子量糖類，在制糖行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，在這樣的植物糖制品中一般都有糖化酶的殘留。蜂蜜中葡萄糖和果糖的含量約為65％，是極易以糖摻假的食品。近年來，我國蜂蜜質(zhì)量安全問題不斷出現(xiàn)，2002年歐盟及一些國家對(duì)中國蜂蜜采取禁進(jìn)和停止銷售的貿(mào)易壁壘，給中國養(yǎng)蜂業(yè)帶來了很大的損失。因此，為了監(jiān)測(cè)蜂產(chǎn)品中的摻糖造假，建立一種快速檢測(cè)蜂蜜中摻入的外來淀粉糖化酶（失活或未失活）的方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　

2、 蜂蜜中摻糖造假的檢測(cè)方法主要有碳穩(wěn)定同位素比值分析法(SIRA)、紅外光譜鑒別法、高效液相色譜法等。SIRA對(duì)鑒定蜂蜜中摻入C4植物糖有很好的效果，但對(duì)摻入以C3植物為原料生產(chǎn)的淀粉糖不能鑒別，給檢測(cè)蜂蜜是否存在植物糖摻假帶來一定的困難;紅外光譜鑒別法雖然前處理簡(jiǎn)單，操作步驟方便、快捷，鑒定的準(zhǔn)確度較高，但是設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高;高效液相色譜法靈敏度高，但設(shè)備昂貴，前處理凈化要求高。免疫學(xué)方法，特別是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，

3、由于其具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，得到了大范圍的推廣。本試驗(yàn)旨在研究一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)蜂蜜中淀粉糖化酶殘留的酶聯(lián)免疫學(xué)方法。
　　 本研究采用淀粉糖化酶免疫新西蘭大白兔，獲得抗淀粉糖化酶的多克隆抗體，Western-blot檢測(cè)顯示，制備的多克隆抗體與GA有很好的特異性反應(yīng)。并用淀粉糖化酶免疫原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)獲得了12株可穩(wěn)定性分泌針對(duì)GA抗體

4、的雜交瘤細(xì)胞株，Western-blot檢測(cè)顯示，制備的單克隆抗體與GA有很好的特異性反應(yīng)。對(duì)其中的6株單抗(McAb-2H4F9、6H9D8、8F2F11、8F2E9、1A8G6、1C4D5)細(xì)胞株采用體內(nèi)誘生法制備腹水，腹水的效價(jià)均為1:1×104以上。
　　 采用抗體疊加試驗(yàn)對(duì)這6株抗糖化酶單抗的抗原識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)增值結(jié)果表明，6株單抗分別針對(duì)4類不同抗原位點(diǎn)，McAb-6H9D8和McAb-8F2F11針對(duì)同一抗

5、原決定簇;McAb-1A8G6和McAb-1C4D5針對(duì)第Ⅱ種抗原決定簇;McAb-8F2E9針對(duì)第Ⅲ種抗原決定簇;McAb-2H4F9針對(duì)第Ⅳ種抗原決定簇。用辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記McAb-6H9D8，為建立雙抗夾心ELISA方法提供特異性的酶標(biāo)抗體。
　　 分別用多抗和用單抗包被，建立雙抗夾心ELISA方法。結(jié)果顯示，以單抗包被為基礎(chǔ)建立的檢測(cè)方法特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。本試

6、驗(yàn)中，用特異性單抗和酶標(biāo)特異性單抗相結(jié)合建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)法。
　　 包被抗體(McAb-2H4F9)的最佳包被濃度為12mg/L，GA溶液的最佳稀釋度為1:100，酶標(biāo)抗GA單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1:1000。研究結(jié)果表明，建立的雙抗夾心ELISA方法特異性良好，與α-淀粉酶(α-G)和β-呋喃果糖苷酶(β-F)無交叉反應(yīng)。將該方法初步應(yīng)用到蜂蜜的檢測(cè)中。當(dāng)樣品液作8倍以上稀釋時(shí)，基本無基質(zhì)干擾。在5～80ng/m