硫酸軟骨素化學(xué)發(fā)光法的快速測(cè)定及其ELISA雙抗體夾心法的建立.pdf

1、肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,近十年來,肺癌的研究雖已取得了不少成績(jī),但迄今為止肺癌對(duì)人類健康仍然有很大威脅.在我國(guó)肺癌發(fā)生率與病死率也有明顯升高的趨勢(shì).據(jù)統(tǒng)計(jì),約有70﹪的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中、晚期,失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī),如能早期發(fā)現(xiàn)可以使患者的5年生存率明顯提高.隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞能分泌一些活性物質(zhì),通過現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段能夠檢測(cè)出來,這些活性物質(zhì)被稱為腫瘤標(biāo)志物.腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn),檢測(cè)

2、腫瘤的發(fā)生生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、判斷療效及預(yù)后等方面均有重要的意義. 目前應(yīng)用較多的肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、組織多肽抗原(TPA)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)等,但由于靈敏度和特異性較低,臨床應(yīng)用受到制約.所以,長(zhǎng)期以來,人們一直致力于尋找靈敏度和特異性都較高的肺癌腫瘤標(biāo)志物,硫酸粘多糖是近些年來研究較多的一種肺癌腫瘤標(biāo)志物.許多研究表

3、明硫酸粘多糖在非小細(xì)胞肺癌中有較高的陽性率(86.20﹪),而且特異性和敏感性都較高(特異性為96.55﹪,敏感性為86.20﹪),提示硫酸粘多糖可能是協(xié)助肺癌診斷的一個(gè)很好的標(biāo)志物.硫酸粘多糖的正確命名是糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG),它是由糖醛酸與乙酰氨基糖或其硫酸酯組成的二糖單位形成的重復(fù)序列.哺乳動(dòng)物的GAG包括硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮膚素(Dermatan su

4、lfate,DS)、硫酸角質(zhì)素(Karatansulfate,KS)、肝素(Haparin,HP)、硫酸肝素或硫酸乙酰肝素(Haparan,HS)及透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)6種.研究發(fā)現(xiàn),硫酸粘多糖在肺癌早期即有升高,無論原發(fā)還是轉(zhuǎn)移性肺癌,癌組織中均有GAG含量增高,主要以透明質(zhì)酸(HA)和硫酸軟骨素(CS)的升高為主. 目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道的檢測(cè)硫酸軟骨素的方法很多,如比色法、色譜法、電泳法、配位滴定法

5、、原子吸收法等.但這些方法都有其自身的局限性,主要是靈敏度低,本課題希望建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)硫酸軟骨素的方法,為下一步建立檢測(cè)硫酸粘多糖的方法奠定基礎(chǔ).方法和結(jié)果: 1.采用Ced<'4+>-Na<,2>SO<,3>-H<,2>SO<,4>氧化還原體系,并利用該體系中加入硫酸軟骨素后發(fā)光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)的特點(diǎn),建立了一種快速測(cè)定硫酸軟骨素的化學(xué)發(fā)光分析方法.檢測(cè)結(jié)果如下:回歸方程為y=0.4219x+3.3532,r=0.

6、9968(其中y為樣品RLU與空白R(shí)LU的差值,x為CS濃度),線性范圍為1.Omg/L8.0m/L,檢出限為0/5mg/L.本部分初步建立了硫酸軟骨素的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法,為以后的研究奠定基礎(chǔ). 2.為了制備多克隆抗體,用硫酸軟骨素作為免疫原分別免疫了4只BALB/c小鼠和2只日本大耳白兔.制備的抗血清分別用間接ELISA測(cè)效價(jià)和特異性,結(jié)果如下:4只BALB/cdJ、鼠抗血清終點(diǎn)效價(jià)分別為:1:6400,1:12800,1:6

7、400,1:3200,特異性良好;2只日本大耳白兔抗血清終點(diǎn)效價(jià)分別為1:64000,1:128000,且特異性良好. 3.通過優(yōu)化條件,初步建立了硫酸軟骨素的異種動(dòng)物雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法.選取的檢測(cè)優(yōu)化條件為:包被抗體是1:200的2號(hào)鼠抗血清,封閉液是1﹪?yán)业鞍?第二抗體是1:20000的2號(hào)兔抗血清,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgC(HRP-IgG)濃度是1:4000.檢測(cè)結(jié)果如下:回歸方程為y=0.2945x+0

8、.3968..r=0.9819(其中y為陽性孔OD值和陰性孔OD值之差,x為ln[CS]),線性范圍是2～800 mg/L,且該方法的特異性良好.高、中、低3個(gè)濃度的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值分別為4.48﹪和5.97﹪. 4.用間苯三酚分光光度法檢測(cè)硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品,結(jié)果如下:回歸方程為y=0.0011x-0.0106,(y是吸光度,x是CS的濃度),相關(guān)系數(shù)r=0.9918,線性范圍為200～800 mg/L.以間苯三酚

9、分光光度法為標(biāo)準(zhǔn)參比方法驗(yàn)證異種動(dòng)物雙抗體夾心ELISA方法的可靠性,檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性和配對(duì)t檢驗(yàn)分析,t=-0.247,P>0.05,r=0.999,P<0.01,表明2種方法相關(guān)性良好,ELISA檢測(cè)結(jié)果可靠.結(jié)論:1.建立了快速測(cè)定硫酸軟骨素的化學(xué)發(fā)光法,回歸方程為y=0.4219x+3.3532,r=0.9968(其中y為樣品RLU與空白R(shí)LU的差值,x為CS濃度),線性范圍為:1.0 mg/L～8.0 mg/L,方法的檢出限