中成藥中氰苷類有毒成分的篩查、定量測定和體外轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、中醫(yī)中藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，長期實(shí)踐和研究表明，其在臨床治療上有著獨(dú)特的療效。自馬兜鈴酸事件發(fā)生以來，中藥安全性問題引起了國際上的廣泛關(guān)注，嚴(yán)重制約了中藥國際化發(fā)展進(jìn)程。中藥毒副作用是伴隨著中藥療效同時出現(xiàn)的，最早從《神農(nóng)本草經(jīng)》開始就將中藥分為上、中、下三品，其中下品治病，有毒者多，不可長期服用。常用的有毒中藥大致可分為5類，即生物堿類、毒苷類、毒性蛋白類、動物類和礦物類，其中毒苷類又可分為強(qiáng)心苷類、皂苷類和氰苷類。為了保證中藥使用的安

2、全性，對中藥中有毒物質(zhì)需要制定限量標(biāo)準(zhǔn)。
　　論文以氰苷類有毒中藥為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行研究，氰苷是由氰醇衍生物的羥基和糖縮合形成的糖苷，不僅是該類有毒中藥中的有毒成分，也是其有效成分。苦杏仁苷為氰苷類化合物的代表，也是常用中藥材苦杏仁、桃仁、郁李仁的有效成分，苦杏仁苷主要通過體內(nèi)酶解生成氫氰酸而產(chǎn)生藥理活性，小劑量氫氰酸可以鎮(zhèn)咳平喘，但大劑量會導(dǎo)致中毒。中國藥典2015版一部中規(guī)定，苦杏仁中苦杏仁苷含量不得少于3.0％，藥典中收載的含有苦

3、杏仁的中成藥有66種，其中葶貝膠囊中具體規(guī)定了每粒膠囊（0.35g）中的苦杏仁苷含量不得少于0.55mg，但對于同時作為內(nèi)源性毒性成分的苦杏仁苷而言，其安全限量尚屬空白。
　　論文致力于氰苷類中成藥中苦杏仁苷的限量標(biāo)準(zhǔn)研究。中成藥中的苦杏仁苷一般以一對差向異構(gòu)體的形式存在，命名為D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷，在一定的條件下可以相互轉(zhuǎn)化。D-苦杏仁苷為天然存在形式具有明確的藥理活性，而L-苦杏仁苷的活性機(jī)制未見報道。所以探討了D-和L

4、-苦杏仁體外轉(zhuǎn)化過程和酶解產(chǎn)毒差異，針對中成藥中的苦杏仁苷的存在形式、含量、轉(zhuǎn)化規(guī)律以及毒性代謝產(chǎn)物氫氰酸檢測等問題開展了深入研究，為此類中成藥中苦杏仁苷安全限量的制定提供科學(xué)依據(jù)。全文共分為四章。
　　第一章為前言，首先對中藥的發(fā)展現(xiàn)狀和國際化進(jìn)程做了簡要的介紹，隨著中藥不良反應(yīng)事件的頻發(fā)，安全性問題已成為中藥發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵性問題，因此對目前已有的有毒物質(zhì)評價機(jī)制進(jìn)行了概述。其次主要介紹了氰苷類有毒中藥的種類、分布、結(jié)構(gòu)、體

5、內(nèi)代謝過程以及產(chǎn)毒機(jī)制等背景研究，由于氰苷類本身既是有效成分也是有毒成分，所以對于中成藥中氰苷的含量測定顯得尤為重要。故以苦杏仁苷為代表，分別對其原型和代謝產(chǎn)物HCN的檢測方法進(jìn)行歸納總結(jié)，為進(jìn)一步的研究提供參考依據(jù)。最后提出本論文的立題依據(jù)和主要的研究內(nèi)容。
　　第二章，基于苦杏仁苷異構(gòu)體的體外酶解過程，初步評估D-和L-苦杏仁苷的活性差異。首先系統(tǒng)研究了苦杏仁苷天然存在的D型結(jié)構(gòu)向L型轉(zhuǎn)化的影響因素，運(yùn)用半制備液相色譜技術(shù)獲得

6、 L-苦杏仁苷對照品，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定和確證，在得到L-苦杏仁苷對照品的基礎(chǔ)上，研究了D-和L-苦杏仁苷體外酶解規(guī)律。結(jié)果表明堿性條件是苦杏仁苷異構(gòu)化的重要因素之一，D-苦杏仁苷在pH11的NaOH溶液中靜置30分鐘為轉(zhuǎn)化生成L-苦杏仁苷的最佳條件。在此基礎(chǔ)上，對苦杏仁苷差向異構(gòu)體混合物進(jìn)行了分離提純，制備得到純度為99.7%的L-苦杏仁苷對照品，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過質(zhì)譜和核磁共振譜的確證。體外酶解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-和L-苦杏仁苷酶解產(chǎn)毒過程中存

7、在明顯差異。在相同條件下，D型苦杏仁苷的酶解速率常數(shù)是L型的7.7倍。由于苦杏仁苷在體內(nèi)同樣是經(jīng)酶解生成氫氰酸發(fā)揮藥效，所以酶解速率的不同將導(dǎo)致氫氰酸暴露劑量的差異，可能導(dǎo)致D-和L-苦杏仁苷在藥效與毒性等方面存在差異，D-苦杏仁苷酶解速率更快，可能在發(fā)揮藥效上起著更大的作用。
　　第三章，基于建立的高效液相色譜方法（HPLC）對氰苷類中成藥中苦杏仁苷的含量進(jìn)行測定，重點(diǎn)關(guān)注不同來源和劑型的中成藥中D-和L-苦杏仁苷的含量及其轉(zhuǎn)化

8、。首先，建立了靈敏準(zhǔn)確的測量中成藥中D-和L-苦杏仁苷含量的HPLC方法，并開展了相關(guān)的方法學(xué)研究。結(jié)果表明，D-和L-苦杏仁苷在2～500mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為0.999，檢測限為0.8mg/L，定量限為2mg/L，精密度、回收率、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合要求，說明該方法穩(wěn)定可靠。然后，以含有苦杏仁的中成藥為代表，通過該方法對17種42個批次的中成藥中的D-和L-苦杏仁苷含量以及異構(gòu)化比例進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D-苦杏仁苷含

9、量范圍是0.018%～1.158%，L-苦杏仁苷含量范圍是0.003%～0.434%，異構(gòu)化比例范圍是8.03%～53.35%。基于異構(gòu)化比例的差異可能導(dǎo)致不同的藥理活性及毒性等問題，本課題針對通宣理肺方劑開展相關(guān)研究，通過比較不同劑型的通宣理肺方劑以及不同來源的通宣理肺丸中D-和L-苦杏仁苷的含量和異構(gòu)化比例，發(fā)現(xiàn)中成藥的劑型、工藝和來源等因素均可能對苦杏仁苷的差向異構(gòu)化比例產(chǎn)生影響。研究表明劑型因素是D-苦杏仁苷向L-苦杏仁苷轉(zhuǎn)化的

10、重要因素，劑型工藝越復(fù)雜，生成的L-苦杏仁苷的含量越高。該結(jié)果可為相關(guān)中成藥產(chǎn)品的工藝優(yōu)化提供借鑒，且所得含量及異構(gòu)化比例等研究結(jié)果可為氰苷類中成藥中苦杏仁苷的安全限量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。最后，基于多級質(zhì)譜技術(shù)，針對不同種類氰苷，開展了質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究，研究表明氰苷化合物中糖基與氰醇間C—O鍵容易斷裂，形成多糖或單糖的特征峰?？偨Y(jié)已有氰苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對于氰苷篩選以及未知氰苷的結(jié)構(gòu)鑒別具有借鑒意義，為實(shí)現(xiàn)氰苷物質(zhì)快速篩選策略提供試驗(yàn)依

11、據(jù)。
　　第四章，立足復(fù)雜基質(zhì)，建立了表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)和氣相色譜(GC)兩種方法，快速檢測中成藥提取液中氫氰酸的含量。鑒于氰苷化合物在中成藥加工或口服過程中有可能發(fā)生自身酶解而產(chǎn)生氫氰酸，本課題致力發(fā)展針對中成藥中氰化物的簡單靈敏的檢測方法。SERS技術(shù)具有快速、靈敏、便攜等特點(diǎn)，在現(xiàn)場檢測中具有極大的優(yōu)勢，但是在復(fù)雜基質(zhì)中，會受到其他物質(zhì)的嚴(yán)重干擾。因此本課題通過設(shè)計(jì)在線凈化富集裝置，解決了復(fù)雜基質(zhì)中測量CN-的難題

12、。通過在線凈化富集裝置檢測不同濃度氰化物對照品，檢測限為0.05mg/L，在濃度范圍0.1～2mg/L內(nèi)線性良好，R2為0.997，由于拉曼散射強(qiáng)度容易受光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)等因素的影響，且線性范圍較窄，為了驗(yàn)證該SERS方法的有效性和可靠性，所以本課題進(jìn)一步發(fā)展了定量更為準(zhǔn)確的GC方法檢測中成藥中氰化物含量，并對其進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法在范圍0.05～50mg/L內(nèi)的線性良好， R2為0.996，定量限為0.05mg/L，檢測限為0

13、.025mg/L。運(yùn)用這兩種方法，對不同的氰苷類中成藥進(jìn)行測量，結(jié)果表明僅在個別中成藥中檢出氰化物，表面增強(qiáng)拉曼光譜和氣相色譜的檢測結(jié)果基本一致。通過氣相色譜方法的分析結(jié)果所得，中成藥中HCN含量最高26.60mg/L，未達(dá)到人體中毒劑量，但由于中成藥一般為長期服用，所以長期低劑量毒性效應(yīng)不可忽視。另外，發(fā)現(xiàn)測得氰化物的中成藥均為丸劑，可能由于丸劑加工工藝簡單，制備過程中酶沒有完全失活，所以中成藥中苦杏仁苷的限量，需要對D-和L-苦杏仁