阿維鏈霉菌一氧化氮合酶的基因克隆及生物功能初步研究.pdf

1、一氧化氮合酶(NOS)是一種基于亞鐵血紅素的單個氧化酶,具有將L-精氨酸氧化成NO和瓜氨酸的功能。它合成的NO作為一種化學信號分子和細胞毒劑,在高級生物體中具有極其廣泛的生物調(diào)控作用。雖然人類在許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了類似于真核生物一氧化氮合酶(euNOS)的基因序列,但迄今為止我們只研究了少數(shù)細菌的一氧化氮合酶(bNOS)的功能。據(jù)研究顯示,哺乳動物的一氧化氮合酶具有一個氧化域和一個專門提供電子的還原域。但細菌中的一氧化氮合酶卻缺乏還原域和

2、類似專門的電子供體。因此,有些人推斷bNOS的功能可能不同于euNOS的功能,包括消化不同的代謝物質(zhì)和抗氧化保護能力方面。關(guān)于bNOS的研究可能會令人類對NOS的機理有全新的認識,并發(fā)現(xiàn)NOS的新功能。由于阿維鏈霉菌基因組中也存在著bNOS的一段高同源性的未知基因序列。本文決定對阿維鏈霉菌的類似nos基因序列進一步確認,并對其在鏈霉菌屬的生物功能進行初步研究,以進一步豐富關(guān)于微生物bNOS的功能研究材料,為微生物的科學利用提供新的思路。

3、
　　 本文從基因組提取阿維鏈霉菌基因組DNA,通過PCR手段成功釣取到阿維鏈霉菌一氧化氮合酶類似基因(sanos)DNA。經(jīng)生物信息學的分析,發(fā)現(xiàn)該序列與NCBI上公布的NOS Streptomyces avermitilisMA-4680 DNA(編號為NC-003155)的同源性高達99％,與Streptomyces scabiei(編號為NC-013929)的同源性高達84％,與Homosapiens(編號為NP_001

4、123373.1)的同源性達69％,可初步確定為一氧化氮合酶序列。此外,該序列由516aa組成,分子量約為56.4kDa,理論等電點pI=6.71,為不穩(wěn)定的親水性蛋白。而且相較大多數(shù)細菌一氧化氮合酶,它的N-端具有N-端鉤和鋅環(huán)指區(qū)域,與哺乳動物的一氧化氮合酶結(jié)構(gòu)更加接近。
　　 為進一步驗證sanos是真正的一氧化氮合酶序列,我們設計了阿維鏈霉菌一氧化氮合酶(saNOS)體外轉(zhuǎn)錄實驗,通過構(gòu)建pET28a-saNOS表達載體

5、,并利用IPTG誘導saNOS在大腸桿菌中進行表達,并對誘導表達體系進行了優(yōu)化。實驗結(jié)果顯示,當IPTG濃度為0.2mM,IPTG誘導表達時間為8h時,saNOS蛋白表達量最大。經(jīng)一氧化氮合酶試劑盒測定saNOS活性,確定sanos是一氧化氮合酶序列,且能轉(zhuǎn)錄翻譯成具有活性的一氧化氮合酶。
　　 在此基礎上,本文通過接合轉(zhuǎn)導技術(shù)獲得擁有saNOS基因的天藍色鏈霉菌突變株M-1,并利用RT-PCR技術(shù)驗證了saNOS在天藍色鏈霉菌

6、中的表達效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變株M-1相較原始菌株,氣生菌絲和包子發(fā)育都有所延緩,但抗生素Act和Red的生產(chǎn)時間則不變。其中,Act合成量提高,Red合成量降低。此外,通過研究添加NO供體SNP、NO淬滅劑cPTIO和NO抑制劑L-NMMA對阿維鏈霉菌的影響,發(fā)現(xiàn)高濃度NO能延緩阿維鏈霉菌的形態(tài)分化,且能提高黑色素的分泌量。因此,我們可推斷:在形態(tài)分化方面,saNOS產(chǎn)生的高濃度NO雖然不會阻斷鏈霉菌的形態(tài)分化過程,但具有延緩作用。在次