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文檔簡介
1、抗膽堿能藥物能抑制膽堿能神經(jīng)功能,從而治療呼吸系統(tǒng)疾病。光學(xué)純的奎寧醇是抗膽堿能藥物的一種重要中間體,因其3位的手性碳,使其具有(S)-奎寧醇和(R)-奎寧醇兩種構(gòu)型。(R)-奎寧醇是抗膽堿能藥物瑞伐托酯的中間體,其生物合成方法已經(jīng)多有報道。(S)-奎寧醇是抗血清素受體拮抗劑藥物和抗膽堿藥物的中間體。其合成通常是通過構(gòu)型轉(zhuǎn)化的方法,以3-奎寧酮為原料,經(jīng)硼氫化鉀還原、與乙酰氯成酯、水解得到。該合成(S)-奎寧醇的方法較為繁瑣,若引入生物
2、催化劑使得奎寧酮一步還原為(S)-奎寧醇,將既能解決繁瑣的反應(yīng)步驟這一不足,又能得到光學(xué)純的(S)-奎寧醇。在前期的工作中,本工作通過菌種篩選技術(shù),從土壤中篩選獲得一株能還原奎寧酮不對稱合成(S)-奎寧醇的菌株-紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis WY1406)。該菌株能將奎寧酮不對稱還原為光學(xué)純的(S)-奎寧醇,轉(zhuǎn)化率達(dá)95%,ee值大干99%。但由于利用野生菌株生產(chǎn)具有培養(yǎng)周期長,活性較低等不足,作為催化劑
3、在應(yīng)用上具有一定的局限性。
本課題采用基因克隆的技術(shù),利用已報道的奎寧酮還原酶基因?yàn)樘结槪瑢t球菌屬基因組進(jìn)行分析比對,在基因庫中進(jìn)行篩選,利用得到的基因組進(jìn)行引物設(shè)計,并從已有的紅串紅球菌株中克隆得到羰基還原酶基因,并將其表達(dá)在大腸桿菌BL21(DE3)中,對構(gòu)建成功的基因工程菌驗(yàn)證其活性及立體選擇性。結(jié)果表明,利用通過篩選得到的29條引物進(jìn)行基因克隆,得到16條基因,經(jīng)過大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)后,僅有一個基因ReQ
4、R-16表達(dá)為包涵體,其余的均為可溶性表達(dá)。利用粗酶液檢測它們催化奎寧酮還原的活性及立體選擇性,發(fā)現(xiàn)只有6個基因表達(dá)的酶能還原奎寧酮,其中有2個基因表達(dá)的酶還原產(chǎn)物的ee值大于99%。最終,利用該基因的全細(xì)胞進(jìn)行放大規(guī)模的催化反應(yīng)研究,發(fā)現(xiàn)基因ReQR-25表達(dá)的目標(biāo)酶能在14h內(nèi)轉(zhuǎn)化5g/L的底物奎寧酮轉(zhuǎn)化率達(dá)93%。
通過本實(shí)驗(yàn)所得到的帶有奎寧酮還原酶基因的基因工程菌,能在較短時間內(nèi)獲得一種新的單一構(gòu)型的奎寧醇產(chǎn)物。彌補(bǔ)了
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