Bacillus pumilus CN8菌株高效降解豬血Hb酶的分離純化與降解機(jī)制探討.pdf

1、我國是畜禽血液生產(chǎn)大國，原料血液難保存，畜禽血液的綜合利用效率不高。利用微生物降解畜禽血液，投入低，能耗省，蛋白質(zhì)、肽和氨基酸含量高，是血液綜合利用的一個方向。Bacillus pumilus CN8菌株是本課題組多年篩選與選育的一株具有高效降解豬血血紅蛋白能力的菌株。
　　 Bacillus pumilus CN8菌株的發(fā)酵液，經(jīng)10000r/min冷凍離心15min，取上清液得到粗酶液，再經(jīng)硫酸銨鹽分步鹽析，鹽析時先將硫酸銨

2、的飽和度增加到40％，去除大部分雜蛋白，然后將飽和度調(diào)到60％。冷凍離心收集沉淀，將沉淀溶解后用透析袋進(jìn)行透析，再經(jīng)過DEAE-Cellulose-52離子交換層析等步驟獲得電泳純級的蛋白酶。與粗酶液相比，純化后得到的蛋白酶比酶活達(dá)686.66U/mg的蛋白酶，純化倍數(shù)為13.2，回收率為35.0％。SDS-PAGE測得其分子量大約為86.92KDa。
　　 通過對酶學(xué)性質(zhì)展開研究，得到以下結(jié)論：粗酶與純酶的酶學(xué)性質(zhì)接近，該酶的

3、最適作用pH值為7.3，最適反應(yīng)溫度為42℃，在pH6.5-9.5時能保持較高的酶活力，屬于典型的中性蛋白酶；從穩(wěn)定性來看，該酶在pH6.5-9.5范圍內(nèi)酶活比較穩(wěn)定：在30-45℃比較穩(wěn)定。不同金屬離子對酶活的影響是不同的。K+對酶活有顯著的激活作用，Cu2+、Mn2+、Sn2+、Cd2+濃度過高和過低時均對Bacillus pumilus CN8蛋白酶的酶活有抑制作用，且隨著這些金屬離子濃度的增大，對該蛋白酶酶活的抑制作用也越大。Z

4、n2+在較低濃度下對酶活的影響不是很大，隨著濃度的增大，對酶活的抑制作用略有增強(qiáng)。Fe2+、Na+、Ca2+、Mg2+等對蛋白酶無激活或抑制作用。K+、Mg2+對酶活力具有保護(hù)作用。甘油對于酶活具有抑制作用。吐溫80對蛋白酶的活性幾乎沒有影響，司班20和吐溫20對蛋白酶的活性有促進(jìn)作用。
　　 Bacillus pumilus CN8菌株蛋白酶活力為1400U/mL，Hb降解產(chǎn)物中即可溶性蛋白、游離氨基酸含量分別為5.02％、3

5、4.6mg/100mL,Hb的降解產(chǎn)率為59.12％。通過紫外掃描光譜分析得出：血紅蛋白經(jīng)Bacillus pumilus CN8菌株降解后在250nm-280nm之間出現(xiàn)了幾個吸收峰，說明在降解過程中血紅蛋白分解成了多肽、寡肽或氨基酸等物質(zhì)，血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過傅里葉變換紅外光譜分析，可以判斷BacilluspumilusCN8菌株作用于血紅蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基后，發(fā)酵液所含物質(zhì)的成分發(fā)生了結(jié)構(gòu)和某些性質(zhì)的改變。氨基酸自動分析

6、儀的測定結(jié)果也說明了Bacillus pumilus CN8菌株對豬血血紅蛋白具有降解作用。血紅蛋白經(jīng)BacilluspumilusCN8菌株作用后，通過SEM掃描觀察血紅蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化。得出：血紅蛋白的粒徑變得細(xì)小，蜂窩狀結(jié)構(gòu)消失，表面的孔洞結(jié)構(gòu)不復(fù)存在，排列不再規(guī)則，說明Bacillus pumilus CN8菌株作用后，Hb的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了根本性質(zhì)的改變。
　　 本文針對Bacillus pumilus CN8蛋白酶、

7、中性蛋白酶、胃蛋白酶水解豬血血紅蛋白的動力學(xué)特征進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究；以酶解初速度為評價指標(biāo)，得到了三種酶的最佳反應(yīng)溫度與pH，其中Bacillus pumilus CN8蛋白酶的最佳溫度為37℃、pH值為7.0；中性蛋白酶的最佳溫度為45℃、pH值為7.3；胃蛋白酶的最佳溫度為30℃、pH值為1.5。三種蛋白酶按Km值排序從小到大依次為：Bacillus pumilus CN8蛋白酶＜胃蛋白酶＜中性蛋白酶；Vmax從大到小依次是：Ba