甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫的構(gòu)建及TILLING、EcoTILLING技術(shù)的應(yīng)用研究.pdf

1、突變體是某個性狀發(fā)生可遺傳變異或某個基因發(fā)生突變的生物體材料。早期的遺傳學(xué)家和育種家們主要在小范圍內(nèi)篩選感興趣的突變體，隨著近年來多種生物基因組序列的測序完成，大量基因等待著人們?nèi)ピ忈屍涔δ?，因此小范圍的獲得突變體已經(jīng)不能滿足科研和育種的需要。所以，在后基因組時代，創(chuàng)建能夠使突變覆蓋某一生物體全基因組的突變體庫成為必然。在蕓苔屬植物中，目前很少有大型突變體庫構(gòu)建的報道。此外，如何構(gòu)建突變體庫以及如何檢測和篩選這些突變體成為困擾研究人員新

2、的難題。TILLING（靶向誘導(dǎo)基因組局部突變）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一門反向遺傳學(xué)技術(shù)，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于動植物功能基因組研究和作物遺傳育種中。該技術(shù)主要用于針對靶基因篩選由人工誘變產(chǎn)生突變體庫中的突變體。芥酸是蕓苔屬作物種子中脂肪酸重要成分，也是衡量蕓苔屬作物品質(zhì)的重要性狀之一。作為食用而進(jìn)行利用的甘藍(lán)型油菜種子中低芥酸含量是其育種的重要目標(biāo)，但對于甘藍(lán)型油菜而言，低芥酸種質(zhì)資源是相當(dāng)匱乏的。調(diào)查已有自然和人工培育品種種子中芥酸含量

3、的變異，以及創(chuàng)建新的低芥酸種質(zhì)資源對于蕓苔屬，尤其是甘藍(lán)型油菜意義十分重大。
　　 本研究首先利用甘藍(lán)型油菜半冬性品種寧油7號（Ningyou7）的一個DH系作為野生型親本材料，通過EMS誘變劑誘變后獲得了大型突變體庫。該突變體庫利用了兩種EMS誘變濃度。0.6％EMS濃度的突變體庫包含M2代單株7110；0.3％EMS突變體庫包含M2代單株3926。同時，還獲得了這些突變體材料M2代自交種子和其對應(yīng)的DNA。然后，對突變體庫所

4、有材料M2代生育期內(nèi)的性狀進(jìn)行了調(diào)查。主要包括株型、葉片性狀、開花期相關(guān)形狀、育性、M3代部分種子含油量等。經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，本研究構(gòu)建的突變體庫中含有大量表型變異突變體。
　　 在TILLING技術(shù)平臺構(gòu)建實驗中，首先利用甘藍(lán)型油菜Tapidor基因組BAC文庫，篩選并獲得了FAE1基因?qū)?yīng)的克隆。對篩選獲得FAE1的BAC克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在甘藍(lán)型油菜基因組中存在兩個拷貝。然后利用本實驗室構(gòu)建的作圖群體（TN mappin

5、g population），結(jié)合分析FAE1 BAC克隆的序列信息，開發(fā)分子標(biāo)記，將兩個拷貝的FAE1定位在了甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖．A8和C3連鎖群上；同時利用兩年兩點(diǎn)的作圖群體種子芥酸數(shù)據(jù)定位了甘藍(lán)型油菜種子中芥酸含量的QTL，發(fā)現(xiàn)兩個拷貝的FAE1基因位于兩個芥酸主效QTL的峰值處。然后，通過改進(jìn)的TILLING技術(shù)，在構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫中篩選了FAE1基因的突變體。在1344個M2單株中共獲得了19個單株在FAE1篩選

6、區(qū)段含有突變位點(diǎn)。計算獲得了兩種不同濃度誘變產(chǎn)生突變體庫的突變密度。對于0.3％EMS誘變濃度的單株，對應(yīng)的突變密度為每單株每130.8 kb含有一個突變位點(diǎn)；0.6％EMS誘變濃度群體，對應(yīng)的突變密度為每單株每41.5 kb含有一個突變位點(diǎn)。選取其中兩個種子中芥酸變異單株進(jìn)行詳細(xì)遺傳分析，發(fā)現(xiàn)這些突變體芥酸的降低均因為．FAE1基因的變異。
　　 在EcoTILLING技術(shù)平臺構(gòu)建及芥酸變異關(guān)聯(lián)分析實驗中，首先收集了128份蕓

7、苔屬品種，其中白菜8份、甘藍(lán)9份、甘藍(lán)型油菜101份。利用氣相色譜分析法分析了這些不同品種種子中芥酸的含量，發(fā)現(xiàn)在這近130份收集品種，既有高芥酸品種，也有中芥酸和低芥酸品種。然后，利用EcoTILLING技術(shù)分析了甘藍(lán)型油菜101份品種兩個拷貝FAE1的多態(tài)性，并且分析了這些多態(tài)性和高低芥酸的關(guān)聯(lián)性。同時還分析了白菜、甘藍(lán)品種中高低芥酸產(chǎn)生的可能原因。最后，利用EeoTILLING實驗中推斷出的甘藍(lán)型油菜單倍型序列和白菜、甘藍(lán)測序分析