1、L-酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)屬芳香族氨基酸，在生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物豐富多樣，其中許多具有重要生理功能和藥理特性，而且在發(fā)酵食品中其產(chǎn)物種類和含量會(huì)對(duì)食品的安全和生理效應(yīng)產(chǎn)生重要影響，因此深入研究微生物對(duì)L-酪氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物很有必要。同時(shí)，通過微生物轉(zhuǎn)化的研究可以開發(fā)L-酪氨酸代謝產(chǎn)物更為清潔高效的生物酶生產(chǎn)方法，對(duì)于推動(dòng)其重要代謝產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥、飼料、化工、疾病檢測等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有重要研究價(jià)值和實(shí)踐意義。
本研
2、究從自然界富集得到106株菌株，通過初篩、復(fù)篩和重復(fù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，篩選得到菌株ZL-20，在不同條件下可轉(zhuǎn)化得到8個(gè)產(chǎn)物。16SrDNA分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示與Bacillusmegaterium同源率高達(dá)99.0％，結(jié)合其生理生化試驗(yàn)綜合分析后鑒定為巨大芽孢桿菌。通過對(duì)其產(chǎn)酶培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件等的優(yōu)化，得到了其中3個(gè)主要產(chǎn)物各自單一產(chǎn)生的條件，并使轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化濃度得到較大幅度提高。其中，產(chǎn)物①優(yōu)化后24h轉(zhuǎn)化率達(dá)到65％以上，較優(yōu)化前
3、提高21％左右;產(chǎn)物②36h轉(zhuǎn)化率達(dá)到75％以上，較優(yōu)化前提高33％左右;產(chǎn)物③48h轉(zhuǎn)化率高達(dá)98％，較優(yōu)化前提高25％左右。
在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)化液預(yù)處理、有機(jī)溶劑萃取、離子交換樹脂分離、Prep-HPLC制備等對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離提取，并運(yùn)用等電點(diǎn)冷卻結(jié)晶、濃縮結(jié)晶以及重結(jié)晶等方法進(jìn)一步純化，經(jīng)HPCE和HPLC純度檢測，產(chǎn)物①晶體純度達(dá)98％以上，產(chǎn)物②達(dá)96％以上，產(chǎn)物③達(dá)95％以上。最后采用NMR和MS技術(shù)分別對(duì)三個(gè)
4、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并結(jié)合ZL-20菌株16SrDNA分子鑒定結(jié)果和KEGGPathwayDatabase中L-酪氨酸代謝通路進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明:產(chǎn)物①為L-多巴，化學(xué)式為C9H11NO4，屬于黑色素途徑，L-酪氨酸經(jīng)多酚氧化酶等羥基化而生成;產(chǎn)物②為4-羥基-烯醇-苯酮酸，化學(xué)式C9H8O4，屬于氧化分解途徑，首先經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等作用生成對(duì)羥苯基丙酮酸，再經(jīng)苯丙氨酸互變異構(gòu)酶催化生成;產(chǎn)物③為對(duì)羥基苯乙胺，化學(xué)式C8H11NO
5、，也屬于氧化分解途徑的一個(gè)分支，是L-酪氨酸在酪氨酸脫羧酶等作用下氧化脫羧生成。其中，苯丙氨酸互變異構(gòu)酶在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫中已知的菌屬類型并沒有芽孢桿菌。因此推測，該酶可能是在芽孢桿菌中未被發(fā)現(xiàn)的一種新酶。
綜上，本研究篩得的菌株ZL-20穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物豐富;經(jīng)條件優(yōu)化和分離提取，對(duì)其中三個(gè)產(chǎn)物順利完成了分析鑒定，建立起了一套L-酪氨酸代謝產(chǎn)物分析研究的有效方法。為后續(xù)更多新產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、具有工業(yè)應(yīng)用潛力酶資源的開發(fā)