過(guò)量表達(dá)GAD系統(tǒng)關(guān)鍵基因提升乳酸乳球菌γ-氨基丁酸生產(chǎn)性能.pdf

1、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降低血壓、鎮(zhèn)定安神、預(yù)防癲癇、調(diào)節(jié)激素分泌、改善睡眠、抗抑郁和保肝利腎等多種生理功能，因此受到廣泛關(guān)注。在制備GABA的多種方法中，生物催化合成法因反應(yīng)周期短、環(huán)境友好而備受矚目。大腸桿菌Escherchiacoli以其生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)一度成為制備GABA的熱門(mén)菌種，然而E.coli因存在安全隱患而無(wú)法應(yīng)用于食品工業(yè)。因此，尋求

2、更加安全、高效的GABA生產(chǎn)菌株顯得尤為重要。
　　本文以工業(yè)化細(xì)胞工廠中的模式菌株Lactococcus lactis NZ9000為宿主細(xì)胞，通過(guò)代謝工程和微生物生理生化分析等技術(shù)手段考察了過(guò)表達(dá)Lc.lactis subsp.lactis CV56谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)抗酸系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因?qū)ζ銰ABA合成性能的影響，同時(shí)探究了影響重組工程菌株催化活性的主要因素，并于最優(yōu)反應(yīng)條件

3、下考察游離乳酸菌細(xì)胞催化性能。
　　首先，Lc.lactis subsp.lactis CV56基因序列分析顯示gadB基因全長(zhǎng)1401bp，編碼466個(gè)氨基酸，理論推算的分子量約為53.8 kDa。與其它功能已知的GAD相類似，GADCV56含有高度保守的賴氨酸殘基(K277)、蘇氨酸殘基(T213)和天冬氨酸殘基(D245)，以及一段高度保守的{H(I/V)DAASGG}基序。通過(guò)構(gòu)建重組載體pET28a-gadB及重組菌株E

4、.coli BL21(DE3):pET28a-gadB，實(shí)現(xiàn)了GAD CV56在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)。所獲取的重組GADCV56具有催化L-谷氨酸(L-Glu)生成GABA的能力，其最適pH為4.7，最適反應(yīng)溫度為50℃;且重組GAD熱穩(wěn)定性較高，在60℃條下保溫2h后仍能保持40％以上的酶活。動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定顯示其Km值為3.88 mM，Vmax為58.66U/mg。
　　采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取編碼GAD和Glu-GABA反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

5、的基因片段，分別構(gòu)建至Lc.lactis NZ9000中，獲取重組工程菌株Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB。在搖瓶發(fā)酵條件下，兩菌株與對(duì)照菌株Lc.lactis NZ9000的生長(zhǎng)相似，外源基因的導(dǎo)入沒(méi)有導(dǎo)致重組工程菌株生物量的明顯下降。GAD在Lc.lactis NZ900中過(guò)量表達(dá)時(shí)，經(jīng)誘導(dǎo)45h后，發(fā)酵液中GABA的含量是對(duì)照組的7.02倍;而

6、在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步過(guò)量表達(dá)Glu-GABA反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)，菌體細(xì)胞中反應(yīng)底物和產(chǎn)物的跨膜輸送過(guò)程得到強(qiáng)化，從而表現(xiàn)出更高的催化活性，GABA產(chǎn)量是對(duì)照組的16.63倍。同時(shí)，將gadB-CV56基因片段克隆入pNZ8149中，并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)，獲得可直接應(yīng)用于食品行業(yè)的食品級(jí)重組工程菌株Lc.lactis NZ3900:pNZ8149-gadB。
　　以Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB為對(duì)象，考察靜息態(tài)

7、細(xì)胞催化時(shí)菌齡、緩沖體系、反應(yīng)液pH值、溫度、5'-磷酸吡哆醛(PLP)對(duì)其合成GABA能力的影響。研究結(jié)果顯示其最適反應(yīng)條件為:菌體誘導(dǎo)時(shí)間4h，以pH4.2的醋酸-醋酸鈉緩沖液為反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度45℃。在最適反應(yīng)條件下進(jìn)行游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞體外催化60h后，Lc.lactis NZ9000:pNZ8148-gadB和Lc.lactisNZ9000:pNZ8148-gadCB催化合成GABA產(chǎn)量分別為37.71g/L和43.32