生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)作為一種天然存在的非蛋白質氨基酸，具有多種重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和化工領域應用廣泛。通過益生性乳酸菌催化生產(chǎn)GABA已是人們目前普遍共識。然而，理解乳酸菌中GABA合成途徑及其表達調控機制是強化乳酸菌作為細胞工廠高效生產(chǎn)該物質的前提。本文以課題組從鮮牛奶中分離得到的一株GABA高產(chǎn)菌株短乳桿菌(Lactobacillus brevis CGMCC1306

2、)為出發(fā)菌株，在解析其谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)(GAD system)表達調控機制及關鍵蛋白催化特性，分析菌株GAD系統(tǒng)、F1Fo-ATPase質子泵、胞內微環(huán)境及耐受酸脅迫之間關系的基礎上，采用生理工程策略通過代謝工程與合成生物學手段強化乳酸菌GAD代謝途徑、調控胞內微環(huán)境及細胞膜通透性，實現(xiàn)了高產(chǎn)工程菌株及混合發(fā)酵體系的構建與GABA的高效合成。主要結果如下:
　　(1)建立了短乳桿菌遺傳操作方法，通過實時熒光定量PCR(Quanti

3、tativereal-time PCR)和基于溫敏性pGhost4系統(tǒng)的染色體無痕敲除技術等手段解析了Lb.brevis CGMCC1306染色體上gad operon的轉錄表達調控機制，并探討了GAD系統(tǒng)中關鍵蛋白在細胞抵御酸脅迫及GABA合成過程中的作用。研究表明:Lb.brevis CGMCC1306含有兩個谷氨酸脫羧酶基因，其中gadB與其上游的gadR及gadC連鎖并以基因簇gadRCB形式存在于染色體上;gadA遠離該基因簇

4、單獨出現(xiàn)在染色體上;gadC與gadB形成gadCB operon，共同轉錄和表達;gadR單獨轉錄表達，并陽性調控gadCB operon的轉錄，為促進因子。gadCB operon所編碼的蛋白是該菌株GAD活性的主要提供者，對細胞抵御酸脅迫起到了重要的作用。
　　(2)建立了基于比色法的高GAD活性菌株高通量篩選方法，并成功獲取了兩株F1Fo-ATPase活性弱化但GAD活性增強的Lb.brevis突變菌株。分析了F1Fo-A

5、TPase活性弱化菌株與對照菌株胞內微環(huán)境的差異，為理解GAD活性增強的原因和采用生理工程策略改造菌株提升GABA合成效率提供了理論支撐。結果顯示:Lb.brevis的GABA合成過程與細胞內外pH、細胞膜FoF1-ATPase活性及菌株GAD系統(tǒng)關鍵蛋白催化性能之間存在著緊密關系。在適宜的酸脅迫條件下過量表達GAD系統(tǒng)關鍵蛋白并適當弱化F1Fo-ATPase活性，能夠有效促進Lb.brevis生產(chǎn)GABA的性能。其中，基于上述理論所獲

6、取的重組菌株Lb. brevis/pMG36e-gadA的F1Fo-ATPase缺陷突變株Lb.brevis NRA6具有相對較高的GAD活性。控酸(pH5.2)厭氧批次發(fā)酵條件下，該工程菌株在48 h內可累積GABA至43.65 g/L，轉化率高達98.42％;為野生菌株的1.22倍。
　　(3)通過篩選并理性改造來源于植物乳桿菌的谷氨酸脫羧酶(LpGadB)，獲得了C-末端截短的但具有相對更寬泛催化pH范圍的LpGadB突變體

7、LpGadB△C11。在此基礎上，基于生理工程策略合理組合GAD系統(tǒng)關鍵蛋白及突變體并強化其表達，有效促進了Lb.brevis的GABA合成效率。其中，重組菌株Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC在分批補料發(fā)酵過程中，72 h可有效產(chǎn)生GABA高達104.38 g/L，為野生菌株的1.28倍。與此同時，采用上述策略并以乳酸菌模式菌株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis NZ9000）為出發(fā)菌株，進一步構建了

8、目標菌株Lc.lactis NZ9000/pNZ8148-LpgadB△11-LcgadC，并考察了其GABA合成性能。自然發(fā)酵條件下，在含有60 g/L MSG的GM17發(fā)酵培養(yǎng)基中，36h時該重組菌株GABA產(chǎn)量達18.94 g/L;而采用兩階段pH調控策略進一步有效增強了菌株GABA合成效率，發(fā)酵36 h時，GABA產(chǎn)量積累至30.89 g/L，為自然發(fā)酵條件下產(chǎn)量的1.63倍;而48 h發(fā)酵結束時，GABA產(chǎn)量高達32.16 g

9、/L，轉化率為87.92％，為目前基于乳酸乳球菌細胞批次發(fā)酵生產(chǎn)GABA所報道的最高水平。
　　(4)通過合成生物學手段建立了基于溫和型乳球菌噬菌體(lactococcalbacteriophage rlt)裂解盒（LytHA）與糞腸球菌（Ec.faecalis LMG2333）細菌素(EnlA)的乳酸菌混合發(fā)酵體系中可控裂解平臺工程菌株。實現(xiàn)了共培養(yǎng)體系中Lc.lactis細胞的可控裂解及Lb.brevis細胞膜的透性化，有效削

10、弱了GABA合成過程中Glu/GABA跨膜運輸阻力，進一步提升了重組Lc.lactis及Lb.brevis細胞合成GABA的效率。在Lc.lactics NZ9000/pNZ8148-LcgadB與pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB的混合催化體系中，36h時GABA濃度達37.64 g/L;而在pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB與Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC的混合發(fā)酵體系中，48