生物催化異黃腐酚合成8-異戊烯基柚皮素研究.pdf

1、8-異戊烯基柚皮素是啤酒花中發(fā)現(xiàn)的一種具有雌激素作用的異戊二烯基黃酮，被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)最具潛力的植物雌激素。除雌激素作用外，它還具備其他一些生理活性，包括預(yù)防癌癥，調(diào)節(jié)骨代謝，抑制血管增生和抗氧化等。本論文以異黃腐酚為前體，對(duì)8-異戊烯基柚皮素的生物催化合成進(jìn)行了深入研究。
　　 首先建立了生物轉(zhuǎn)化體系中異黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素的同步檢測(cè)方法。檢測(cè)條件為Phenomenex C18反相柱(4.6 mm×250 mm，4μm)

2、，流動(dòng)相：乙腈(A)-1％甲酸溶液(B)，檢測(cè)溫度30℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，跑樣時(shí)間35 min，流動(dòng)相比例為0-20 min，A40％-100％；20-25 min，A保持100％；25-28 min，A100％-40％。
　　 為了有效解決底物異黃腐酚價(jià)格昂貴的問(wèn)題，本文利用高速逆流色譜技術(shù)和化學(xué)異構(gòu)法構(gòu)建獲得了1條高純度異黃腐酚的制備路線，所得的異黃腐酚結(jié)構(gòu)經(jīng)高效液相色譜(HP

3、LC)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)鑒定，純度大于90％，可用于后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化研究。
　　 通過(guò)菌種篩選得到爪哇正青霉AS3.5706(Eupenicillium javanicum)作為生物催化合成8-異戊烯基柚皮素的菌株，同時(shí)確定種子預(yù)培養(yǎng)3 d后的直接生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化法G2作為最佳生物轉(zhuǎn)化方式，并設(shè)計(jì)響應(yīng)面對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的條件為底物添加量0.1 mg/30mL，吐溫80添加量0.2％，接種量1％，葡萄糖濃度1％。

4、在此條件下，8-異戊烯基柚皮素得率可達(dá)6.62％，與未優(yōu)化前相比提高了48.6％。
　　 對(duì)調(diào)控生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶進(jìn)行了初步研究，建立了生物轉(zhuǎn)化體系中O-脫甲基酶酶活測(cè)定方法，對(duì)生物催化合成8-異戊烯基柚皮素的過(guò)程進(jìn)行了分析，利用細(xì)胞色素P450酶抑制劑間接證明參與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的O-脫甲基酶是細(xì)胞色素P450酶系的一種。同時(shí)對(duì)生物轉(zhuǎn)化體系中的O-脫甲基酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)O-脫甲基酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，在30-60