基于二聚人工抗原的β-興奮劑多殘留免疫檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、β-受體激動(dòng)劑分為兩大類：苯胺型類和苯酚型類。其中克倫特羅(Clenbuterol,CLE)，屬于苯胺型類β-受體激動(dòng)劑；而萊克多巴胺(ractopamine,RAC)，屬于苯酚型類β-受體激動(dòng)劑。將其作為動(dòng)物的飼料添加劑，能顯著提高飼料的轉(zhuǎn)化率和瘦肉轉(zhuǎn)化率。但其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入到人體內(nèi)，從而危害人類健康。它們也因此在全球范圍內(nèi)被禁用。
　　本論文利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和膠體金免疫層析法（CGIA）建立

2、了對(duì)β-受體激動(dòng)劑多殘留免疫檢測(cè)的技術(shù)。獲得的結(jié)果如下：
　　1、以對(duì)羥基苯甲醛與硝基甲烷為起始物，并結(jié)合蘭尼鎳還原法，從頭合成萊克多巴胺氨基衍生物，即RAC-NH2。以此生成物為起始物，與克倫特羅一樣進(jìn)行重氮化反應(yīng)，分別合成出RAC-HSA、RAC-BSA、CLE-HSA和CLE-BSA。在此基礎(chǔ)上，將RAC-NH2和CLE按照一定摩爾比混合，進(jìn)行重氮化反應(yīng)，通過(guò)紫外和SDS-PAGE鑒定，分別合成出免疫原CLE-HSA-RAC

3、和包被原CLE-BSA-RAC。
　　2、以合成出的CLE-HSA-RAC做為免疫原，采用常規(guī)免疫方法進(jìn)行免疫小鼠，綜合效價(jià)和靈敏度兩個(gè)方面，選擇2號(hào)小鼠進(jìn)行沖擊免疫，進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)三輪亞克隆后，得到3A2和4D8兩株穩(wěn)定分泌抗CLE-RAC的細(xì)胞株，其中4D8這株細(xì)胞株分泌的單抗，對(duì)CLE-RAC的靈敏度最好，IC50值為0.325±0.021ng/mL，且有64000的效價(jià)。因此選擇4D8細(xì)胞株注入小鼠體內(nèi)，進(jìn)行誘生腹

4、水。
　　3、以CLE-BSA-RAC人工抗原和CLE-RAC單克隆抗體（4D8）建立了檢測(cè)CLE和RAC的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。此方法檢測(cè)CLE和RAC時(shí)的IC50值為0.77ng/mL，最低檢測(cè)限IC10為0.14ng/mL。對(duì)克倫特羅、萊克多巴胺、馬布特羅的交叉反應(yīng)率很高（CR>96％）。同時(shí)對(duì)西布特羅、溴布特羅、馬賁特羅、西瑪特羅、班布特羅和克倫普羅也有一定的特異性(17%

5、受體激動(dòng)劑，沒(méi)有交叉反應(yīng)（CR<0.1%）。在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，豬尿、豬肉、豬肝和飼料的最低檢測(cè)限分別是0.302、0.603、0.804和12.42ng/mL。而最低定量限則分別為：0.518、0.858、1.152和20.583ng/mL。板內(nèi)回收率為78%-118.00%，以及板間回收率為84.00%-114.00%。板內(nèi)變異系數(shù)小于14.04%，板間變異系數(shù)小于7.69%。利用LC-MS/MS法驗(yàn)證，此方法是可靠的。
　　4

6、、采用檸檬酸鈉還原法，制備了CLE-RAC膠體金標(biāo)記抗體，同時(shí)成功制備出膠體金試紙條。肉眼對(duì)CLE和RAC等9種β-興奮劑類藥物的檢測(cè)限可以達(dá)到5ng/mL的水平，與前面結(jié)果icELISA結(jié)果一致，對(duì)β-興奮劑類藥物特異性較高，實(shí)現(xiàn)了多殘留檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)時(shí)間較短，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
　　本論文采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，制備出CLE-RAC單抗，并建立了icELISA法和金標(biāo)試紙條檢測(cè)技術(shù)，為CLE和RAC等β-受體激動(dòng)劑多殘留提供了可靠的檢