基于組合PCR的近緣物種鑒定方法的研究.pdf

1、不同物種在商品價值、品質(zhì)、潛在過敏原種類和受保護(hù)程度等方面存在較大的差異,因此亟需建立一種簡單、快速、可靠、重復(fù)性高的檢測方法來保障消費者的權(quán)益、規(guī)范食品市場和保護(hù)瀕危物種。目前分子學(xué)鑒定方法能夠準(zhǔn)確的區(qū)分不同目、科的物種,但對于同屬的多個近緣物種的區(qū)分仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究改進(jìn)了傳統(tǒng)的物種特異性 PCR,設(shè)計多套中等特異性引物,通過綜合分析幾個PCR的結(jié)果來確定物種的身份。由中等特異性引物建立的多個PCR稱為組合PCR。本文建立的

2、組合PCR方法較傳統(tǒng)物種特異性PCR的優(yōu)勢在于:對序列高度相似的近緣物種設(shè)計只擴(kuò)增一個物種的引物是困難的,而組合 PCR對引物特異性要求較低即允許引物擴(kuò)增幾個物種,因此引物設(shè)計相對容易;傳統(tǒng)物種特異性PCR對假陰性、假陽性結(jié)果很敏感,而組合PCR中個別PCR結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果并不會對鑒定結(jié)果有本質(zhì)的影響,仍然可以根據(jù)組合 PCR的結(jié)果判斷樣本的疑似身份;組合 PCR同時利用了多個目的片段,從多個角度反映樣品身份,比傳統(tǒng)的物種特異

3、性PCR準(zhǔn)確性更高;傳統(tǒng)PCR鑒別物種時,所需的特異性引物數(shù)量一般等于甚至大于待區(qū)分物種的數(shù)量,而組合 PCR中由于各 PCR間交叉效果,其能夠用相對較少的反應(yīng)鑒別多個物種。本文選取金槍魚屬的所有金槍魚(7種)為研究對象,設(shè)計中等特異性引物,建立組合 PCR方法,并驗證了該方法的實用性和準(zhǔn)確性。
　　首先,本文根據(jù)7種金槍魚在NCBI中的序列信息,針對編碼蛋白基因設(shè)計了6套中等特異性引物,并使用經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定的3種金槍魚(長鰭、黃

4、鰭、大目金槍魚)的多個個體探索引物特異性發(fā)揮的合適條件。理論上使用5個 PCR反應(yīng)(共使用4套引物和3個反應(yīng)條件)即可對5種金槍魚身份進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分,可將另外2種金槍魚與其他金槍魚分開。
　　其次,根據(jù)一定條件下3種金槍魚種內(nèi)多個個體的PCR結(jié)果的一致性和對引物結(jié)合位點直接測序兩種方法,對引物種內(nèi)保守程度進(jìn)行評價。兩種評價結(jié)果均表明:實驗所用的4套引物種內(nèi)保守程度良好。雖少數(shù)個體的個別引物結(jié)合位置存在變異,但變異位于引物5端,對PC

5、R結(jié)果影響基本可以忽略。
　　再次,通過對真實樣品的序列測定,總結(jié)了在特定條件下引物真實的區(qū)分模板的能力。同時結(jié)合沒有實際樣品的金槍魚種的數(shù)據(jù)庫中信息,得出能夠鑒別7種金槍魚的組合PCR模型(共使用4套引物)。結(jié)果表明:4套引物針對7種金槍魚建立了6種組合PCR模型;長鰭和太平洋藍(lán)鰭金槍魚間序列的高度相似性,這兩種魚具有相同的PCR模型,本文針對金槍魚建立的組合PCR方法尚不能區(qū)分它們。
　　另外,本文利用上述方法鑒別市售的

6、金槍魚身份并對部分樣品(未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品)測序建立基因樹或SNP位點分析,結(jié)果表明:組合PCR鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定、其他分子學(xué)方法鑒定的結(jié)果一致,從而驗證了組合 PCR結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性。
　　最后,本文建立了快速提取DNA的方法,所得DNA的完整性高。本文還對錯配堿基種類、數(shù)目、聚合酶種類、引物模板比對引物區(qū)分能力的影響進(jìn)行簡單探索,這對組合 PCR引物設(shè)計和條件優(yōu)化有一定的參考價值。經(jīng)過優(yōu)化后的組合PCR方法更加簡單、快速。<