基于多孔硅的肽指紋圖譜檢測(cè)及人體指紋成像技術(shù).pdf

1、生物識(shí)別技術(shù)包括體液、組織、細(xì)胞中內(nèi)源性分子的模式識(shí)別和外部特征識(shí)別。內(nèi)源性分子的模式識(shí)別是組學(xué)研究的主要手段，從基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、肽組學(xué)和代謝組學(xué)獲得的信息進(jìn)行模式識(shí)別后可用于疾病診斷。低分子量蛋白質(zhì)或肽（統(tǒng)稱LMWPs）的含量和種類蘊(yùn)藏著大量的基因表達(dá)及代謝信息，因而對(duì)人體體液中LMWPs信息的挖掘正成為一種新型的疾病診斷方法。本論文在生物質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種能高效富集LMWPs，并能進(jìn)行原位檢測(cè)的多孔硅(PSi)材料，該材

2、料可獲取高保真度的肽指紋圖譜，借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)手段可從中挖掘疾病相關(guān)信息。而基于外部特征的識(shí)別技術(shù)主要包括人臉識(shí)別技術(shù)、指紋識(shí)別技術(shù)等等。本論文利用PSi獨(dú)特的電化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)特征，建立了一種免標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光成像(ECLi)技術(shù)，并將其用于潛在指紋的成像和爆炸殘余物等外源性分子信息的檢測(cè)?；赑Si的ECLi技術(shù)將有望與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，更好地實(shí)現(xiàn)生物特征的識(shí)別。論文的主要內(nèi)容包括如下幾個(gè)方面:
　　第一章主要概述了近年來(lái)生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋

3、白質(zhì)/肽組學(xué)及腫瘤診斷研究中的進(jìn)展及存在的問(wèn)題。重點(diǎn)綜述了各種無(wú)機(jī)納米材料及有機(jī)高分子材料在復(fù)雜生物試樣預(yù)處理及質(zhì)譜分析中的應(yīng)用;此外還介紹了多種可視化成像技術(shù)在潛指紋生物外部特征及內(nèi)源性分子識(shí)別中的應(yīng)用。同時(shí)還介紹了PSi發(fā)光的原理及其發(fā)展。最后，在綜述基礎(chǔ)上提出了本論文的選題意義。
　　第二章建立了一種基于納米多孔硅材料快速捕獲血清中LMWPs，并進(jìn)行原位質(zhì)譜檢測(cè)（On-Particle Mass Spectrometric

4、Detection，簡(jiǎn)稱OPMD）的新方法。PSi孔徑大小可通過(guò)電化學(xué)刻蝕條件精確控制，能選擇性地富集低分子肽類而將人血清中高豐度的大分子量蛋白質(zhì)（如血液樣品中的血清白蛋白、免疫球蛋白和蛋白酶等）排阻在孔道外。對(duì)PSi表面進(jìn)行化學(xué)修飾后不僅可提高PSi的穩(wěn)定性，同時(shí)可選擇性地捕獲血清中的LMWPs。富集在PSi顆?？椎乐械腖MWPs無(wú)需洗脫即可直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析離子化(MALDI)質(zhì)譜檢測(cè)。相比于其他預(yù)處理材料，PSi能同時(shí)實(shí)現(xiàn)試

5、樣的保護(hù)，富集，高效排阻及原位檢測(cè)，因而大大地簡(jiǎn)化了分析步驟并提高了基于MALDI-TOF分析的肽譜檢測(cè)靈敏度。我們用PSi顆粒對(duì)10例臨床病的人血清樣品進(jìn)行OPMD，其中5例來(lái)自直腸癌患者，5例來(lái)自健康人。從檢測(cè)結(jié)果可以看到在直腸癌患者和健康人血清樣本中低分子量肽段的差異很明顯。通過(guò)分層聚類分析方法可有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)直腸癌患者和健康人的區(qū)分?；赑Si的OPMD技術(shù)在LMWPs的模式識(shí)別及腫瘤診斷方面有很大的潛力。
　　第三章發(fā)展了

6、多維度顆粒原位質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)（簡(jiǎn)稱多維OPMD），及其在血清肽指紋譜識(shí)別中的應(yīng)用。由于血清中LMWPs的復(fù)雜性，用單一表面化學(xué)的PSi可能造成重要肽段信息的丟失，從而降低疾病診斷的準(zhǔn)確率。本章的研究工作中制備了多種表面化學(xué)修飾（包括季銨鹽、羧基和金修飾）的PSi，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。用已知結(jié)構(gòu)的肽段驗(yàn)證了基于PSi的多維OPMD技術(shù)的可行性。該方法成功地獲取了72例血清樣本的高保真度肽指紋圖譜，其中包括24例結(jié)直腸癌患者、24例肝癌患者

7、和24例健康志愿者。結(jié)果表明不同表面化學(xué)的PSi所獲得的LMWPs圖譜具有良好的互補(bǔ)性，顯著增加了信息容量，降低了肽信息的丟失。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)手段及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法成功篩選出了用于疾病鑒別的特征肽段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多類疾病的同時(shí)判別。我們還進(jìn)行了基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可視化診斷，展示了這種技術(shù)在未來(lái)臨床應(yīng)用的前景。
　　第四章建立了基于PSi顆粒的血清肽信息儲(chǔ)存技術(shù)。血清肽已成為疾病生物標(biāo)志物的豐富來(lái)源。然而由于血清中蛋白酶的作用，樣本采集后血

8、清中LMWPs的組成和相對(duì)豐度將發(fā)生顯著的變化，這會(huì)導(dǎo)致原始肽信息的嚴(yán)重失真進(jìn)而影響疾病判別的準(zhǔn)確率。因此，樣品收集后對(duì)血清肽信息的保存是非常重要的。本文制備了能有效儲(chǔ)存血清中肽譜信息的納米PSi材料，該材料能捕獲、富集和長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)低分子肽段不被降解，還可以對(duì)捕獲肽段的顆粒進(jìn)行免洗脫的OPMD，從而盡可能地保留原始血清樣品中的肽信息。我們?cè)u(píng)價(jià)了該材料在溶液中的尺寸排阻、靜電吸附以及對(duì)血清中低分子蛋白質(zhì)的富集和穩(wěn)定能力。我們通過(guò)對(duì)10例腸

9、癌患者和10例正常人的初始血清樣本和儲(chǔ)存后的血清樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用多孔硅保護(hù)的血清即使在-20℃保存一周后，直腸癌患者的肽譜與正常人的血清肽譜之間仍然可以很好地區(qū)分。而未經(jīng)保護(hù)的血清，經(jīng)過(guò)同樣條件的存儲(chǔ)，已經(jīng)不能用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行區(qū)分，證明了血清肽信息在儲(chǔ)存過(guò)程中的丟失。PSi材料有望作為一種新型的生物樣本儲(chǔ)存材料，大大減少樣品中的分子信息在保存和運(yùn)輸過(guò)程中的信息丟失。
　　生物識(shí)別還包括人體指紋識(shí)別等外部特征的識(shí)別。指紋是

10、人類手指指紋突起處摩擦留下的印跡。指紋中包含了汗水，自然分泌的殘留物，和人體接觸外源性成分的化學(xué)信息。然而，目前的發(fā)光指紋成像技術(shù)通常需要額外的發(fā)光體和共反應(yīng)劑。第五章建立了基于PSi的免標(biāo)記ECLi技術(shù)并將其應(yīng)用于人體指紋成像檢測(cè)。在本工作中，我們發(fā)現(xiàn)，PSi的ECL過(guò)程會(huì)經(jīng)過(guò)活化、增強(qiáng)和衰落的過(guò)程。同時(shí)，處于不同表面化學(xué)環(huán)境的多孔硅電化學(xué)發(fā)光會(huì)顯示出明顯不同的發(fā)光動(dòng)力學(xué)過(guò)程。對(duì)此，我們利用表面化學(xué)影響多孔硅ECL動(dòng)態(tài)過(guò)程的內(nèi)在機(jī)理，