一種利用線粒體DNA鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測方法.pdf

1、近年來隨著市場對羊肉的需求逐漸增加，羊肉的造假現(xiàn)象屢禁不止，不僅擾亂了經(jīng)濟秩序，而且危害人們身體健康。市場上尤以豬肉、雞肉、鴨肉冒充綿羊肉的現(xiàn)象為多。但是現(xiàn)階段我國對羊肉的制作加工沒有任何標準可循，因此，要想打擊假羊肉的制作銷售，首先要制定統(tǒng)一的檢測方法。
　　 本研究的目的是建立一種能夠一次性的快速區(qū)分出綿羊肉中摻入的豬、雞、鴨成分的多重PCR檢測方法。動物的線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)保守、熱穩(wěn)定性好、不易降解的結(jié)構(gòu)特點和

2、母系遺傳、拷貝數(shù)多、進化速度快、不發(fā)生重組的遺傳特點，對線粒體DNA的序列分析所提供的信息已廣泛應(yīng)用于研究物種之間和物種內(nèi)部的系統(tǒng)進化分析、動物源性成分鑒定等領(lǐng)域。
　　 應(yīng)用NCBI的在線BLAST程序、DNAMAN等軟件分析線粒體DNA的保守區(qū)域和多變區(qū)域，用Oligo6.0、Primer5.0等設(shè)計引物，對所設(shè)計的30余對引物逐一進行試驗，最終在線粒體DNA上確定了4對引物。每一對引物分別針對一種動物，能夠檢出4個物種的各

3、自的特異性的線粒體DNA片段，4對引物擴增出來的片段長度有明顯的差異，能在電泳檢測中區(qū)分出來，同時這4對引物退火溫度大致相同、對反應(yīng)體系的要求差別不大（Mg2+濃度對該反應(yīng)影響不大），實現(xiàn)了一次多重PCR反應(yīng)能夠擴增出4種目的條帶。通過全面的試驗，排除了4對引物和4種物種之間發(fā)生相互干擾的可能性，保證了多重PCR反應(yīng)的準確性。最終確定了多重PCR方法的體系和條件。
　　 本研究建立的檢測方法的步驟是:(1)用組織基因組DNA提取

4、試劑盒提取待測樣品的基因組DNA。(2) PCR擴增。(3)電泳檢測擴增產(chǎn)物，與DNA Marker或標準樣品的擴增產(chǎn)物對照確定待測樣品成分。
　　 為了確認該檢測方法的實際應(yīng)用價值，必須估測其靈敏性、準確性。將基因組DNA稀釋1000倍后，用該方法仍能檢測出待測肉樣。待測肉樣的基因組DNA與其他物種的DNA混合后，檢測的靈敏性不受影響。用玉米粉和魚肉模擬實際應(yīng)用時遇到的植物性或動物性雜質(zhì)，在提取DNA時加入玉米粉或魚肉，靈敏性