白樺脂酸對釀酒酵母凋亡的調(diào)控及與酵母液泡蛋白酶Pep4p的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、白樺脂酸（Betulinic acid，BetA）是一種五環(huán)三萜烯，存在于多種天然植物中。近年來發(fā)現(xiàn)白樺脂酸具有抗腫瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗瘧疾等多種生物活性，并且具有抗高膽固醇和肥胖等多種有益于人體健康的特殊功效。近年來發(fā)現(xiàn)白樺脂酸在抗腫瘤方面具有突出的表現(xiàn)，能夠選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且不損傷正常細(xì)胞。因此白樺脂酸是一類很有潛力的無毒副作用的藥物先導(dǎo)化合物。但由于哺乳動物細(xì)胞信號通路復(fù)雜交織，干擾因素較多，因此對于哺乳動物中白

2、樺脂酸抗癌潛力的精確機(jī)制的研究仍是一項巨大挑戰(zhàn)，白樺脂酸的直接分子目標(biāo)還有待于確認(rèn)。由于細(xì)胞凋亡過程的保守性，以及酵母作為分子生物學(xué)模式物種的先天優(yōu)勢，我們采用酵母這種模式生物代替復(fù)雜的哺乳動物細(xì)胞來探究白樺脂酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。同時也為闡明白樺脂酸誘導(dǎo)哺乳動物癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制提供幫助。
　　釀酒酵母液泡中Pep4p（也稱為酵母蛋白酶A）是人類組織蛋白酶D的同源蛋白。Pep4p不僅在催化蛋白質(zhì)水解及其他酶的轉(zhuǎn)錄加工

3、中發(fā)揮作用，近年來人們發(fā)現(xiàn)其參與酵母細(xì)胞凋亡調(diào)控，與線粒體AAC（ADP/ATP載體）蛋白共同干預(yù)線粒體的降解。我們通過研究酵母中液泡蛋白酶與線粒體的相互作用，可能為哺乳動物類凋亡中線粒體與溶酶體介導(dǎo)的信號途徑間的復(fù)雜交互作用提供新的認(rèn)識。
　　本學(xué)位論文主要以下幾個方面開展研究:1、白樺脂酸對酵母細(xì)胞的毒性作用;2、白樺脂酸誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡是否以凋亡的形式進(jìn)行;3、白樺脂酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制;4、Pep4p在白樺脂酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

4、過程中的作用。
　　論文采用20ug/mL白樺脂酸作用于酵母細(xì)胞，通過細(xì)胞蘭活力試劑盒檢測酵母的細(xì)胞活力，通過平板實(shí)驗(yàn)檢測酵母細(xì)胞的存活率。采用DAPI染色、AnnexinⅤ/PI染色和TUNEL染色法檢測酵母細(xì)胞的凋亡，并借助透射電鏡觀察酵母細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著白樺脂酸處理時間的增加，酵母細(xì)胞的細(xì)胞活力逐漸降低、死亡率隨之增加，并且伴隨著核碎片的產(chǎn)生、染色質(zhì)收縮、磷脂酸絲氨酸外翻、DNA斷裂等明顯的凋亡表征。所以白

5、樺脂酸引起的細(xì)胞死亡主要是以凋亡形式進(jìn)行的。使用活化Caspase熒光染色試劑金檢測酵母細(xì)胞內(nèi)caspase的活性。同時，采用dihydroethidium(DHE)及Rhodamine123分別檢測酵母細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生及線粒體膜電位的變化。以q-PCR法檢測了酵母caspase-Yca1及Aif1、Ndi1、Cyc1、Cyc7、Fis1和Dnm1這六種與線粒體相關(guān)的凋亡基因表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白樺脂酸處理后，酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水