高磺基丙氨酸神經(jīng)毒性機(jī)制及中藥單體小檗堿拮抗作用的研究.pdf

1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名日期：別燁年“月心日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意

2、學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名論文導(dǎo)師簽名弛日期：硝年衫月J日的機(jī)制研究提供一個新的方向與靶標(biāo)，為抗AD藥物的研發(fā)提供一個思路。研究方法第一部分選用永生系小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞，首先用MTT比色法，使用HCA0卜2ll

3、lM的濃度范圍作用于細(xì)胞624h，探討HCA的量效和時效關(guān)系。結(jié)合MTT試驗(yàn)結(jié)果，檢測HCA誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑，AnnexinVFITC／PI試劑盒流式檢測分析、Hochest33258／PI熒光染色檢測、Westernblot檢測caspase3／Cleave—caspase3、Bcl一2／Bax通路表達(dá)變化，進(jìn)而檢測細(xì)胞凋亡和壞死的情況；活性氧H2DCF—DA與DHE熒光染色，westernblot檢測Nrf2／HOi通路的變化，判

4、斷氧化應(yīng)激的程度：GSH試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)GSH的含量；羅丹明123(Rodamine123)染色，流式分析檢測細(xì)胞膜電位的變化；MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同通路抑制劑(SP600123、SB203580、PD98059)對HCA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響，然后用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測JNK／c—Jun蛋白表達(dá)變化情況。第二部分通過MTT實(shí)驗(yàn)選用常見的抗氧化中藥單體小檗堿、川芎嗪、桂皮酸、桂皮醛、咖啡酸和咖啡酸苯乙酯，參照文獻(xiàn)使用濃度，對HT22

5、細(xì)胞預(yù)處理30min，再與ImMHCA共同孵育24h，用MTT法篩選出具有明顯保護(hù)作用的中藥單體，在進(jìn)一步對有效中藥單體進(jìn)行量效分析。用熒光染色法檢測中藥單體對HCA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的影響，細(xì)胞內(nèi)GSH的含量用GSH試劑盒檢測；羅丹明123染色后流式分析細(xì)胞膜電位變化，MTT實(shí)驗(yàn)檢測有效中藥單體與不同通路抑制劑聯(lián)合使用對HCA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響，Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)通路(Bcl2、JNK、Nrf2、Akt)蛋白表

6、達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一部分本部分研究發(fā)現(xiàn)，HCA可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞呈劑量和時間依賴性的神經(jīng)毒性，使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死，但是不依賴于Caspase3通路。另外，HCA增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，降低細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化功能的GSH含量，抑制Nrf2通路，破壞線粒體膜電位，激活Bcl2通路，同時也觀察到HCA激活JNK通路，促使pJUK和pc—Jun蛋白水平的升高，并且其變化被JNK通路抑制劑SP600125顯著抑制。第二部分本部分研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體