拮抗腹瀉致病菌乳酸菌的篩選及其作用機制研究.pdf

1、腹瀉是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒死亡最常見的疾病。目前治療腹瀉的藥物大多為抗生素，經(jīng)常服用這些藥物不僅會破壞正常腸道菌群，也不能夠徹底將腸道中的致病菌殺死，因而常常會復發(fā)。近年來人們對于益生菌治療致病菌引起腹瀉的興趣越來越廣泛，但是對其機理并不是很明了。本論文篩選能夠抑制致病菌生長和黏附的乳桿菌，對于乳桿菌的腸道生存能力進行了評價，并且對乳桿菌抑制致病菌黏附、生長和侵入的機理進行了研究。
　　本論文主要篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌生長和黏

2、附的乳桿菌，并且對其適應腸道環(huán)境：耐酸、耐膽鹽和黏附性能進行評價。從中國西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及人類糞便樣品中分離的170株潛在乳桿菌作為篩選菌株。對這170株乳桿菌進行初篩，篩選出抑菌能力較強的44株乳桿菌。以鼠李糖乳桿菌 L.GG的抑菌能力作為參照對這44株乳酸菌進行篩選，最終篩選出14株抑菌圈直徑大于15 mm，并且能夠同時抑制鼠傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和艱難梭菌的乳酸菌菌株。對這14株乳酸菌進行抑制致病菌黏附的篩選，最終篩選出

3、7株使致病菌黏附數(shù)量降低到2×104 CFU/mL的乳酸菌，然后對其進行腸道生存能力評價。實驗結(jié)果顯示這7株乳桿菌在pH2的條件下處理2 h后存活的乳酸菌依然能夠達到107 CFU/mL左右，而在0.3％的膽鹽環(huán)境中處理2 h后菌數(shù)降低到原來的百分之一。單層細胞上黏附的乳桿菌數(shù)量 J5、G15和F0533能夠達到106 CFU/mL，顯示了較強的黏附能力。經(jīng)過綜合分析評價篩選出F0533、IN4125、G15、J5和M7這5株乳酸菌進行

4、后續(xù)機理的研究。運用16 S rDNA基因技術和BIOLOG鑒定五株乳酸菌 F0533、IN4125、G15、J5和M7分別為Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。
　　這5株乳桿菌從競爭、排除和取代三種方式抑制腸道致病菌黏附到 HT-29

5、細胞上，其中L. paracasei M7的抑制效果最好，對三種致病菌的競爭性抑制黏附抑制率分別為93%、83%和87%。研究結(jié)果顯示乳桿菌在抑制致病菌黏附的過程中表面層蛋白（S-層蛋白）發(fā)揮著重要作用，用5 mol/L LiCl處理乳桿菌菌體后乳桿菌抑制致病菌黏附的效果明顯降低，而L. paracasei M7對致病菌黏附的抑制率則降為49%、55%和73%(P<0.05）。根據(jù)SDS-PAGE分析，提取的S-層蛋白分子量為60 kD

6、a，其疏水性氨基酸的含量為43.2%。在鼠傷寒沙門氏菌侵入細胞之前和之后，分別用 S-層蛋白處理鼠傷寒沙門氏菌均能夠降低致病菌的黏附效果。用流式細胞儀分析HT-29細胞的細胞周期，結(jié)果表明S-層蛋白能夠調(diào)控鼠傷寒沙門氏菌對于細胞周期的影響，經(jīng)過S-層蛋白處理后細胞的S期占整個細胞周期的30.13%，而用鼠傷寒沙門氏菌單獨處理的細胞周期為26.88%。此外，S-層蛋白能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌引起的細胞凋亡酶活性的提高，經(jīng)過 S-層蛋白處理的

7、細胞和單獨用鼠傷寒沙門氏菌處理相比細胞凋亡酶活性顯著降低（P<0.05）。
　　研究了這5株乳酸菌的抑菌性能及其代謝產(chǎn)物對于鼠傷寒沙門氏菌細胞組成的改變。實驗結(jié)果表明，乳桿菌上清液能夠抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，其中L. rhamnosus F0533抑制鼠傷寒沙門氏菌生長的效果最好，抑制率達到64%(P<0.05）。此外乳桿菌上清液還能夠殺死鼠傷寒沙門氏菌，經(jīng)過上清液混合處理2 h后鼠傷寒沙門氏菌的菌數(shù)降低了兩個數(shù)量級。經(jīng)過上清液

8、處理的鼠傷寒沙門氏菌菌體細胞內(nèi)的ATP酶含量受到顯著變化，與對照組相比乳桿菌L. rhamnosus F0533能夠使鼠傷寒沙門氏菌菌體內(nèi)的ATP酶含量降低20%。通過傅里葉紅外分析經(jīng)過乳桿菌上清液處理的鼠傷寒沙門氏菌菌體，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌菌體細胞膜的脂肪酸和細胞壁上的多糖類物質(zhì)等都受到影響。
　　最后乳桿菌抑制鼠傷寒沙門氏菌侵入腸道上皮細胞的機制進行了研究。乳桿菌通過對鼠傷寒沙門氏菌破壞細胞上的緊密連接蛋白和細胞骨架的影響來抑

9、制鼠傷寒沙門氏菌侵入細胞。研究結(jié)果顯示乳桿菌能夠阻止因為鼠傷寒沙門氏菌破壞而導致的細胞膜電位的降低（P<0.05），維持細胞膜電位穩(wěn)定。乳桿菌能夠保護細胞緊密連接蛋白和肌動蛋白的結(jié)構，結(jié)果顯示乳桿菌對于細胞膜電位、細胞緊密連接蛋白和肌動蛋白的保護，預防的效果要強于修復作用。乳桿菌能夠增加上皮細胞上的表皮生長因子的含量，比鼠傷寒沙門氏菌破壞的細胞含量提高40%左右。表皮生長因子的增加使細胞緊密連接蛋白和細胞骨架蛋白mRNA的表達增加了30