雌三醇抗體制備及快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、雌三醇（E3）是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，即使在低濃度下也能發(fā)揮生物效應(yīng)，它會(huì)干擾機(jī)體內(nèi)分泌功能，引起內(nèi)分泌失調(diào)，影響身體健康。近年來(lái)有報(bào)道不法商將雌激素應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖，其危害已成為關(guān)注的焦點(diǎn)，國(guó)家也出臺(tái)了相應(yīng)的法律法規(guī)，禁止雌三醇等雌激素在畜牧生產(chǎn)中的使用，但在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，濫用現(xiàn)象仍然時(shí)有發(fā)生。因此，加強(qiáng)對(duì)雌三醇等雌激素殘留的監(jiān)測(cè)和檢測(cè)十分必要。免疫的方法具體靈敏度高、特異性高、成本較低、快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可以擴(kuò)大食品的抽檢的覆蓋范圍，對(duì)

2、完善構(gòu)建食品安全監(jiān)測(cè)體系和保障人民的生命健康具有重要意義。本研究以雌三醇為對(duì)象，在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)了新的免疫半抗原，制備多克隆抗體和單克隆抗體，同時(shí)建立ELISA及電化學(xué)傳感器的方法，以期滿足不同的檢測(cè)需求。主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　（1）半抗原合成與鑒定。針對(duì)原有雌三醇抗體靈敏度低的問(wèn)題，結(jié)合雌三醇的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在酚羥基位置引入含有兩個(gè)碳原子的末端為羧基的間隔臂，設(shè)計(jì)合成新的免疫半抗原E3-A（雌三醇-3-羧甲基醚），經(jīng)

3、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定合成成功，將半抗原通過(guò)活潑脂法與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，經(jīng)紫外吸收光譜鑒定偶聯(lián)成功。
　?。?）多克隆抗體的制備及高靈敏 icELSIA方法的建立。將新免疫原免疫新西蘭大白兔，制備獲得多克隆抗體，并建立 ELISA分析方法。研究了不同包被原條件下ELISA方法的特異性，結(jié)果表明異源包被直接影響方法檢測(cè)靈敏度以及抗體的特異性。在采用 E2-A-OVA包被時(shí)，ELISA方法對(duì) E3的檢測(cè)限（IC10）=0.01

4、7 ng/mL，IC50=0.185ng/mL，線性范圍為0.041~0.837ng/mL，且對(duì)雌二醇沒有交叉反應(yīng)，特異性高。將該方法用于奶制品樣品中雌三醇的檢測(cè)，結(jié)果表明回收率在85.0％~106.5%之間，具有良好的準(zhǔn)確性。與HPLC-MS/MS方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好（R2=0.973）。
　?。?）單克隆抗體的制備及一步電沉積免疫傳感器方法建立。為進(jìn)一步保證抗體的良好來(lái)源，將免疫原免疫Balb/c小鼠，并取脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)

5、胞融合，制備獲得一株穩(wěn)定分泌 E3單克隆抗體的細(xì)胞株 E3-2C2，體內(nèi)培養(yǎng)制備鼠單克隆抗體mAb-E3-A-BSA，效價(jià)為1:64000，1μg/mL E3抑制率為95.2%?；趩慰寺】贵w建立電化學(xué)免疫傳感器方法。首先通過(guò)循環(huán)伏安法將普魯士藍(lán)-殼聚糖-納米金（PB-CS-AuNPs）修飾在玻碳電極表面，以增加電極的比表面積、導(dǎo)電性和生物親和性。通過(guò)納米金固定包被抗原，蛋白封閉后加入一抗和藥物，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，加入二抗，形成包被抗原