精液和唾液組織差異性甲基化位點(diǎn)的篩選與分析.pdf

1、對犯罪現(xiàn)場的可疑生物檢材進(jìn)行組織來源鑒定，是偵查活動中的重要環(huán)節(jié)之一。近年來，利用DNA甲基化作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行法醫(yī)學(xué)人體組織/體液來源鑒定成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。有研究證實，生物體基因組中存在大量的組織特異性甲基化區(qū)（tDMRs），由此賦予了不同組織細(xì)胞具有指紋般特異性的甲基化譜，通過比對這些特異性甲基化模式，理論上可以區(qū)分不同的組織和細(xì)胞。相比較傳統(tǒng)的生化方法以及基于mRNA或microRNA的組織來源鑒定方法，DNA甲基化標(biāo)記法

2、具有特異性好、穩(wěn)定性高、不需消耗額外樣本、能夠與DNA分型技術(shù)相兼容等優(yōu)勢。隨著DNA甲基化檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，利用DNA甲基化標(biāo)記鑒定組織來源的方法也越來越成熟，但現(xiàn)階段各類研究所篩選出的位點(diǎn)數(shù)量有限且大部分位點(diǎn)僅對精斑檢材有較好的特異性，故還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足法醫(yī)實踐中識別多種組織來源的需要。因此，有必要篩選更多的適用于各種組織鑒定的DNA甲基化差異性標(biāo)記，增加不同組織細(xì)胞DNA甲基化模式的復(fù)雜程度,豐富該遺傳標(biāo)記的多態(tài)性。
　　目

3、的：
　　在全基因范圍內(nèi)篩選可用來鑒定精液、唾液等體液的DNA甲基化差異位點(diǎn)，為組織/體液鑒定尋找新的甲基化遺傳標(biāo)記提供參考。
　　方法：
　　以日常法醫(yī)接觸較多的生物檢材血液、唾液、精液、肌肉作為研究樣本，采用有機(jī)法提取樣本基因組DNA。利用甲基化敏感限制性內(nèi)切酶HpaⅡ?qū)颖綝NA進(jìn)行差異性酶切，酶切后的片段連接RHpa接頭，PCR擴(kuò)增得到差異性酶切片段的擴(kuò)增子。以這些擴(kuò)增子作為各組織樣本基因組的“代表”進(jìn)行消減雜

4、交比較：以精液基因組DNA的擴(kuò)增子作為Tester，其他3種組織體液樣本的擴(kuò)增子作為Driver，將連接上JHpa接頭Tester與過量無接頭的Driver混合進(jìn)行第一次正向消減雜交，再將第一次雜交獲得的差異片段接頭轉(zhuǎn)換為NHpa接頭后進(jìn)行第二次正向消減雜交，經(jīng)過2次正向消減雜交即可富集精液相對其他3種樣本的差異甲基化DNA靶片段。以其他3種組織體液樣本的酶切產(chǎn)物擴(kuò)增子作為Tester，精液基因組DNA的酶切產(chǎn)物擴(kuò)增子作為Driver，

5、進(jìn)行2次反向消減雜交獲得其他3種組織體液樣本相對精液的差異甲基化DNA靶片段。將Tester和Driver分別改換為唾液和其他3種組織體液的基因組DNA，以同樣方法進(jìn)行唾液組織正反向消減雜交，完成唾液相對其他3中樣本的差異甲基化DNA片段的消減雜交富集。對以上消減雜交富集得到的差異甲基化片段進(jìn)行回收、純化、克隆、測序，利用BLAST軟件檢測測序結(jié)果并進(jìn)行靶片段基因組定位，再利用BSP技術(shù)對靶片段區(qū)域的甲基化進(jìn)行定量分析明確靶片段多重Cp

6、G位點(diǎn)的甲基化程度，進(jìn)一步篩選片段中具有組織/體液特異性的甲基化差異位點(diǎn)并進(jìn)行多樣本驗證。
　　結(jié)果：
　　利用MS-RDA方法初步篩選出6條精液特異性甲基化差異候選靶片段（Se-1~Se-6）以及6條唾液特異性甲基化差異候選靶片段（Sa-1~Sa-6），經(jīng)過BSP驗證：在6條精液特異性甲基化差異候選片段中，Se-3靶片段中的CpG位點(diǎn)CpG11、CpG12、CpG13、CpG16、CpG17、CpG18在精液和血液樣本中無

7、甲基化修飾，在唾液樣本中有低甲基化修飾（甲基化水平：0.1~0.17）；Se-5靶片段中的CpG位點(diǎn)CpG2、CpG3、CpG6、CpG16、CpG9在精液和唾液樣本中無甲基化修飾，在血液樣本中有低甲基化修飾（甲基化水平：0.1~0.3）；Se-6靶片段CpG位點(diǎn)中的CpG2、CpG5、CpG6、CpG8、CpG11、CpG13、CpG17、CpG18在精液樣本中無甲基化修飾，在血液樣本和唾液樣本中均存在高甲基化修飾（甲基化水平：0.5

8、~0.7）。在6條唾液特異性甲基化差異候選片段中，Sa-1靶片段中的CpG位點(diǎn)CpG1、CpG4、CpG6、CpG7、CpG8在唾液樣本中表現(xiàn)為完全甲基化修飾，在血液以及精液樣本中有較高甲基化修飾（甲基化水平：0.7~0.9）；Sa-6靶片段各CpG位點(diǎn)在唾液樣本和血液樣本中均表現(xiàn)出高甲基化修飾（甲基化水平：0.9），在精液樣本中表現(xiàn)為低甲基化修飾（甲基化水平：0.1）。
　　結(jié)論：
　　實驗初步篩選出具有精液特異性非甲基化