海洋生物內(nèi)生真菌的分離及抗老年癡呆活性成分研究.pdf

1、老年癡呆癥中最常見(jiàn)的為阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，它嚴(yán)重影響了患者的認(rèn)知功能、記憶功能、個(gè)人及社會(huì)生活能力等。目前，關(guān)于AD病理較為接受的為“膽堿能缺失學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)—乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵原因，故對(duì)AD的治療主要是采用乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、加蘭他敏、石杉?jí)A甲等，通過(guò)抑制乙酰膽堿脂酶，提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿水平，延緩乙酰膽堿的水解速度，發(fā)揮治療作用。但目前的藥物價(jià)格較貴，且具有一定

2、的副作用，化學(xué)合成新的藥物難度大，故天然產(chǎn)物藥物的開(kāi)發(fā)與研究成為研究的重點(diǎn)。海洋微生物生活環(huán)境較為特殊，代謝途徑獨(dú)特，因而具有多種生物活性。因此，本文采集海洋野生的動(dòng)植物，分離其內(nèi)生真菌，以乙酰膽堿酯酶的抑制率為指標(biāo)，進(jìn)行活性菌株的篩選及鑒定，優(yōu)化液體發(fā)酵條件，并分離發(fā)酵液中的活性次生代謝產(chǎn)物，采用波譜學(xué)的方法分析鑒定其結(jié)構(gòu)。本文研究的內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.海洋生物內(nèi)生真菌的分離及抗老年癡呆活性菌株篩選、鑒定
　　

3、 以長(zhǎng)島海域9種海洋動(dòng)物、植物為原材料，對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、純化，分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行液體發(fā)酵，并采用DTNB顯色法測(cè)定各菌種發(fā)酵液抑制乙酰膽堿酯酶活性，篩選具有活性的菌株，并對(duì)其中活性最高的一株菌株P(guān)t-2進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，確定菌株種屬。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從長(zhǎng)島海域采集到的9種生物中分離獲得內(nèi)生真菌42株，具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的33株，其中Pt-2菌株的發(fā)酵液活性最高，抑制率為65.12％。該菌種經(jīng)鑒定為

4、芽枝霉屬，命名為Cladosporiumsp.Pt-2。
　　 2.Cladosporiumsp.Pt-2菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 以發(fā)酵液AchE抑制率為活性指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵時(shí)間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度和碳源、氮源等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。最終得出其最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間9天、接種量5％、裝液量200mL（每500mL三角瓶）、培養(yǎng)溫度25℃，碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏。在此條件下，發(fā)酵液提取物的乙酰膽

5、堿酯酶抑制率較高，為76.32％。
　　 3.Cladosporiumsp.Pt-2發(fā)酵液中抑制AchE活性物質(zhì)的分離
　　 發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，采用硅膠柱層析、反相柱層析、凝膠柱和高效液相等色譜學(xué)的方法進(jìn)行分離，分離得到組分1、2和3，通過(guò)波譜學(xué)的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。最終化合物1確定為環(huán)（纈-亮）二肽，化合物2確定為環(huán)（酪-亮）二肽，組分3經(jīng)GC-MS分析可能含有5個(gè)化合物，分別為3-1甲基睪酮，3-2二苯硫醚，3-