Rhodothermus marinus源UDP-木糖合成通路相關酶的重組表達、酶學特性及應用研究.pdf

1、糖核苷酸是生物體內(nèi)用于糖基轉(zhuǎn)移反應的糖供體底物，在糖生物學和糖生物工程方面都有重要的研究應用價值。木糖(xylose，Xyl)是構成生物體內(nèi)糖鏈結構的重要單糖組分，含有木糖的糖類物質(zhì)已經(jīng)被證實具有很多重要的生物學功能，如動物中木糖參與構成的糖胺聚糖參與了細胞增殖、遷移、粘連、胞間通訊、腫瘤細胞生長及病原體入侵等事件的發(fā)生，而植物和細菌中木糖則廣泛參與構成細胞壁及胞外多糖組分，因此研究糖類物質(zhì)的木糖糖基化合成的生物學意義不言而喻。UDP-

2、木糖(UDP-Xyl)是用于Xyl單糖糖基轉(zhuǎn)移的糖核苷酸供體。在生物體糖核苷酸合成通路中，UDP-Xyl由UDP-xylose synthase(UXS)催化UDP-GlcA脫羧反應生成，而UDP-GlcA則由UDP-glcose dehydrogenase(UGD)催化UDP-葡萄糖(UDP-Glc)脫氫轉(zhuǎn)化生成。用生物酶工程手段合成相關糖核苷酸產(chǎn)物具有易操作、成本低、產(chǎn)物純、產(chǎn)量高的優(yōu)勢，但其依賴于具有高性能的生物酶。由于UDP-G

3、lc容易獲得且比較廉價，因此本論文以UDP-Glc到UDP-Xyl的合成通路中的兩種酶UGD和UXS為研究對象，挖掘具有耐高溫特性的酶并研究其酶學特性及在UDP-Xyl合成中的應用效果。
　　本論文從嗜熱菌Rhodothermus marinus（R.marinus）中發(fā)掘到兩個UGD（RmUGD1和RmUGD2）和一個UXS(RmUXS)酶蛋白基因，研究發(fā)現(xiàn)RmUGD1和RmUXS具有高催化活性、耐高溫等特點，適合于UDP-Gl

4、cA和UDP-Xyl的生產(chǎn)應用，在基礎研究領域，RmUXS是首次從嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)的UXS基因。具體研究成果如下:
　　1.RmUGD1、RmUGD2與RmUXS的克隆表達與序列分析
　　從R.marinus基因組中發(fā)掘并克隆了兩個UGD基因和一個UXS基因，分別命名為RmUGD1、RmUGD2和RmUXS。氨基酸序列同源分析表明這三個基因的氨基酸序列同其他物種中同源基因序列間有很高的保守性，部分序列相似度可達50％以上，但Rm

5、UGD1和RmUGD2之間的保守性僅有29％。蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)RmUGD1和RmUGD2都含有兩個分別位于蛋白序列N-端和C-端的SDR結構，但RmUGD2和RmUGD1相比缺少了N端的UDPG-MGDP-dehydrogenase結構域。RmUXS含有一個典型的加長版的SDR結構，包含一個結合NAD+的結構域(NAD+ binding site)，和兩個底物結合結構域。RmUGD1、RmUGD2和RmUXS三-個基因所表達蛋白質(zhì)均不

6、舍信號肽序列和跨膜結構區(qū)。
　　2.RmUGD1、RmUGD2和RmUXS的體外原核表達及其重組酶活性的檢測
　　RmUGD1、RmUGD2和RmUXS在大腸桿菌BL-21菌株體外表達乖純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，均得到了與理論值相同大小的條帶。UPLC對酶催化反應產(chǎn)物分析結果發(fā)現(xiàn)RmUGD1催化UDP-Glc生成了UDP-GlcA，而RmUGD2沒有催化生成UDP-GlcA，RmUXS催化UDP-GlcA生成了UDP

7、-Xyl且該反應無需添加外源NAD+。由于該類酶的耐高溫特性，簡單的高溫加熱法具有和鎳柱法相同的蛋白純化效果。
　　核磁共振(NMR)和MALDI-TOF的檢測進一步驗證了RmUXS的反應產(chǎn)物。NMR實時檢測表明產(chǎn)物UDP-Xyl隨反應時間不斷增加，而底物UDP-GlcA則隨反應的進行而不斷減少，10分鐘后底物被完全轉(zhuǎn)化。MALDI-TOF檢測結果同樣證實了反應產(chǎn)物UDP-Xyl的生成。
　　3.原核重組表達RmUGD1的酶

8、生化特征的測定
　　用體外酶催化反應的測定結果表明，重組的RmUGD1的最適pH值為9.0，最適反應溫度為60℃，不需要金屬離子作為輔酶。Zn2+和Co2+抑制RmUGD1酶活性，Mg2+對RmUGD1有促進作用，而Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+和Ni2+對RmUGD1均沒有明顯的影響。100 mM和250 mM的NaCl對RmUGD1活性有輕微的促進作用，但當NaCl濃度高于250 mM時，RmUGD1的酶活會

9、受到抑制。SDS可使RmUGD1完全失活，而Triton-X100可略微提升RmUGD1的酶活性。RmUGD1在70℃下較為穩(wěn)定，但在80℃時極易失活。UDP-Xyl可以對RmUGD1產(chǎn)生反饋抑制作用。RmUGD1對NAD+的Km值為25μM，最大反應速率為3.3μM min-1，Kcat值為0.032 min-1;對UDP-Glc的Km值為33μM，最大反應速率為3.4μM min-1，Kcat值為0.102 min-1。RmUGD1

10、的酶的比活力為1.1U/mg。
　　4.原核重組表達RmUXS的酶生化特征的測定
　　用體外酶催化反應的測定結果表明，重組的RmUXS的最造反應pH為7.5，最適反應溫度為60℃。 RmUXS的酶活性也不需要任何金屬離子的添加，Zn2+完全抑制RmUXS的活性，Ni2+、Co2+和Mn2+對RmUXS有抑制作用，而Ca2+、Fe2+和Fe3+可提升其酶活力，Mg2+和Cu2+對酶活性沒有明顯影響。RmUXS的耐鹽能力較弱，從

11、0.1M起，RmUXS的酶活性便隨著NaCl的濃度的上升而不斷下降。UDP和UTP可強烈抑制RmUXS，使其酶活性下降至29％和26％，RmUXS在70℃下有很高的穩(wěn)定性，而在80℃時極易失活。RmUXS對其底物UDP-GlcA的Km值為32μM，最大反應速率為10.2μM min-1，Kcat值為0.102 min-1，酶的比活力為1.7U/mg。
　　5.一釜法合成UDP-Xyl
　　RmUGD1和RmUXS在一釜法試驗