耐鹽橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1社會(huì)行為對(duì)海洋生境適應(yīng)的分子策略.pdf

1、粘細(xì)菌是研究細(xì)菌社會(huì)行為的良好模式材料，其社會(huì)行為主要表現(xiàn)在滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)、攝食和多細(xì)胞協(xié)調(diào)發(fā)育過程，而滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)在細(xì)胞攝食和子實(shí)體發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用。黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)由兩個(gè)獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)調(diào)控：一個(gè)是A運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，主要調(diào)控獨(dú)立的單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；另一個(gè)是S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，主要調(diào)控群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)主要包括三個(gè)組分：IV型菌毛、細(xì)胞外基質(zhì)和O-抗原。黃色粘球菌的運(yùn)動(dòng)調(diào)控系統(tǒng)非常復(fù)雜，迄今為止，發(fā)現(xiàn)

2、的S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相關(guān)基因己超過110個(gè)。 二十世紀(jì)末以前，粘細(xì)菌被普遍認(rèn)為是典型的土壤微生物，分離的陸生菌株不能夠在高于1％的鹽濃度條件下生長。而從1998年日本學(xué)者在海洋樣品中分離到嗜鹽粘細(xì)菌以來，越來越多的粘細(xì)菌從多種海洋環(huán)境中分離純化出來。根據(jù)耐鹽能力的不同，海洋粘細(xì)菌被分為兩類：海洋嗜鹽粘細(xì)菌和海洋耐鹽粘細(xì)菌。 海洋嗜鹽粘細(xì)菌主要是由日本學(xué)者分離到的，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA的分析，這些菌株被歸為四個(gè)新的屬。

3、他們對(duì)海洋嗜鹽粘細(xì)菌的研究主要集中在形態(tài)學(xué)分析、分類以及抗生素等代謝產(chǎn)物分析方面，而關(guān)于粘細(xì)菌在海洋生境中的生活模式、定殖機(jī)制及更深入的分子機(jī)制等方面一直都沒有涉及。 本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年的探索，從海洋樣品中分離到了多株海洋耐鹽粘細(xì)菌。前期實(shí)驗(yàn)中，將其中的橙色粘球菌Myxococcus fulvus HW-1菌株作為一株典型的耐鹽粘細(xì)菌模式菌株，與其它耐鹽粘細(xì)菌或嗜鹽粘細(xì)菌對(duì)比，對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和系統(tǒng)分類學(xué)等特征及運(yùn)動(dòng)和發(fā)育能力進(jìn)

4、行了詳細(xì)的分析。揭示了海洋耐鹽粘細(xì)菌在陸地和海洋生境下存在兩種不同的生活模式；并由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測海洋耐鹽粘細(xì)菌是陸生粘細(xì)菌被帶到海洋生境中適應(yīng)了海水環(huán)境而存活下來，即海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1生活在海洋生境中是適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果。并且發(fā)現(xiàn)，在海水條件下，海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1不僅保留了雙運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，且雙運(yùn)動(dòng)能力尤其是S運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。S運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)可能促進(jìn)細(xì)胞間的粘連，為更好的適應(yīng)海洋生境提供條件，證明社會(huì)運(yùn)

5、動(dòng)在海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1適應(yīng)海洋生境生存過程中發(fā)揮著非常重要的作用。探知自然生境下粘細(xì)菌運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的多樣性和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)可能為我們理解粘細(xì)菌運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的形成和進(jìn)化提供重要線索。 mariner轉(zhuǎn)座因子是來自真核生物的mariner/Tcl超家族的成員，與原核生物的轉(zhuǎn)座子如Tn5相比，有著多種獨(dú)特的性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)簡單、轉(zhuǎn)座作用不依賴宿主的特定因素和隨機(jī)插入等，這些特性使其在自然界中廣泛分布，并可在物種間水平轉(zhuǎn)移。目前

6、，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)ariner轉(zhuǎn)座因子可以在粘細(xì)菌中有效地轉(zhuǎn)座，并且達(dá)到穩(wěn)定整合，是粘細(xì)菌遺傳研究的有力工具之一。 本研究以海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1為材料，建立了一整套適合耐鹽粘球菌的分子遺傳操作體系，為開展耐鹽粘細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和發(fā)育等細(xì)胞行為的分子遺傳學(xué)研究搭建了基礎(chǔ)平臺(tái)；在此基礎(chǔ)上，利用mariner類轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ構(gòu)建了HW-1菌株的小型隨機(jī)插入突變菌庫，從中發(fā)現(xiàn)并深入研究了一個(gè)社會(huì)運(yùn)

7、動(dòng)和發(fā)育相關(guān)的新基因簇mts，該結(jié)果不僅擴(kuò)充了粘球菌社會(huì)運(yùn)動(dòng)和發(fā)育相關(guān)基因文庫，彌補(bǔ)了在模式菌株DK1622中篩選失活后對(duì)運(yùn)動(dòng)僅有微弱影響基因困難的不足，為粘球菌運(yùn)動(dòng)基因的篩選提供了新途徑和新思路，而且開啟了在分子水平上研究海洋耐鹽粘細(xì)菌社會(huì)行為對(duì)海洋生境適應(yīng)機(jī)制的大門，為理解HW-1社會(huì)行為對(duì)海洋生境適應(yīng)的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)中，為了研究與M.fulvus HW-1適應(yīng)海洋生境相關(guān)的S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)基因，首先將marine

8、r·類轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ電轉(zhuǎn)化入M.fulvus HW-1細(xì)胞，通過隨機(jī)插入突變的方法建立了M.fulvus HW-1菌株的隨機(jī)突變菌庫，從中篩選到一株社會(huì)運(yùn)動(dòng)缺陷突變株M.fulvus HL-1利用報(bào)告基因lacZ的表達(dá)驗(yàn)證了突變株HL-1染色體上插入了轉(zhuǎn)座子MirfiHimarl-lacZ，并且發(fā)現(xiàn)突變基因表達(dá)時(shí)間很早、表達(dá)水平很高。 雙運(yùn)動(dòng)能力分析的經(jīng)典方法--“軟硬瓊脂方法”分析結(jié)果顯示：突變株M.fu

9、lvus HL-1 S運(yùn)動(dòng)能力缺陷，A運(yùn)動(dòng)能力受到影響；且令人興奮的是，該突變株在海水條件下運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)的趨勢(shì)明顯減弱、甚至消失，證明突變株M。fulvus HL-1中的突變基因在海洋耐鹽橙色粘球菌M.fulvus HW-1在海水條件下S運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)行為中發(fā)揮著重要的作用。通過發(fā)育平板上發(fā)育能力的檢測證明了突變株M.fulvus HL-1的子實(shí)體形成和粘孢子發(fā)育能力缺陷。分析S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的重要組分細(xì)胞外基質(zhì)的染料結(jié)合實(shí)驗(yàn)、聚集實(shí)驗(yàn)和掃描電

10、鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了突變株M.fulvus HL-1細(xì)胞外基質(zhì)數(shù)量減少，細(xì)胞粘連性降低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：突變株M.fulvus HL-1中的突變基因可能在M.fulvus HW-1社會(huì)行為(運(yùn)動(dòng)和發(fā)育)中、甚至在社會(huì)行為對(duì)海洋生境適應(yīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。 通過質(zhì)粒營救法和Tail-PCR方法獲得了突變株M.fulvus HW-1中轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ插入位點(diǎn)兩側(cè)13 kb序列。通過ORF分析軟件Fr

11、amePlot 3.0beta分析預(yù)測該片段編碼6個(gè)功能相關(guān)的同向轉(zhuǎn)錄ORFs。Genbank上BLASTX比對(duì)結(jié)果表明：在黃色粘球菌Myxococcus xanthus DK1622和粘細(xì)菌中與粘球菌同亞目的另一個(gè)菌株橙色標(biāo)樁菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1基因組上，均有該6個(gè)ORFs的高度同源基因，且中間4個(gè)ORFs及其在DKl622和DW4/3-1中的同源ORFs都與主要來自真核生物的、與細(xì)胞的粘附、

12、運(yùn)動(dòng)和增殖等多種細(xì)胞行為密切相關(guān)的Thrombospondin type 3 repeat家族蛋白同源。因此該基因簇被命名為mrs(意指(_m)yxobacterial (_t)hrombo(_s)pondin-like)，分別編碼MtsA、MtsB、MtsC、MtsD、MtsE和MtsF蛋白。在突變株HL-1中，轉(zhuǎn)座子MiniHimarl-lacZ插入在ORF mtsC的3’末端。結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件SMART分析結(jié)果顯示：MtsA和Mts

13、E N端均有一個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)域，MtsD和MtsE均具有通常在細(xì)胞粘連等行為中發(fā)揮著重要作用的VWA[von Willebrand factor (vWF)type A domain]結(jié)構(gòu)域。 通過菌落擴(kuò)展能力的分析比較證明了mtsC同源基因的插入失活對(duì)M.xanthus DK1622運(yùn)動(dòng)能力的影響遠(yuǎn)低于mtsC插入失活對(duì)M.fulvus HW-1運(yùn)動(dòng)能力的影響。該結(jié)果與PHX(predicted highly expressed)

14、分析軟件預(yù)測的mts及其同源基因表達(dá)水平結(jié)果一致，說明與mtsC同源基因在陸生粘球菌M.xanthus DK1622運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮的作用相比，mtsC在海洋耐鹽粘球菌M.fulvus HW-1運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮的作用更重要，即mtsC甚至整個(gè)mts基因簇可能在M.fulvus HW-1社會(huì)行為對(duì)海洋生境適應(yīng)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。通過mtsC同源基因缺失突變及與已知A和S運(yùn)動(dòng)基因分別構(gòu)建的雙基因突變的分析，證明了mtsC同源基因?qū)儆赟運(yùn)

15、動(dòng)系統(tǒng)基因，在M. xanthus DK1622的S運(yùn)動(dòng)和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。mts同源基因簇的缺失證明mts同源基因簇可能在M. xanthus DK1622的S運(yùn)動(dòng)和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。 通過其它mts同源基因缺失的分析證明了mtsA，mtsB、mtsD、mtsE和mtsF同源基因均在M.xanthus DK1622的S運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用；而除mtsF外，mtsA、mtsB、mtsD和mtsE同源基因也均

16、在M.xanthus DK1622的子實(shí)體形成和粘孢子發(fā)育過程中占有重要的地位。 為了在粘球菌中對(duì)MtsB同源蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位，構(gòu)建了熒光蛋白與MtsB同源蛋白融合表達(dá)菌株，但在該菌株細(xì)胞中沒有檢測到熒光。通過lacZ報(bào)告基因的分析顯示了融合蛋白能夠表達(dá)，但不能正常發(fā)射熒光。 在大腸桿菌中，異源表達(dá)了MtsB及其同源蛋白MXAN1333。通過表達(dá)細(xì)胞破碎液離心后沉淀和上清液中蛋白的分析確認(rèn)了表達(dá)的融合蛋白MtsB和MXA

17、Nl333多數(shù)都呈包涵體形式。提取、純化了融合蛋白MtsB和MXAN1333，并制備了融合蛋白MtsB和MXAN1333的多克隆抗體，為MtsB及其同源蛋白的細(xì)胞定位和表達(dá)時(shí)間譜等功能機(jī)制分析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 通過紫外誘變對(duì)M.fulvus HW-1進(jìn)行了改造，獲得了一株在液體培養(yǎng)基中均勻穩(wěn)定分散生長誘變株M.fulvus UV684。對(duì)UV684進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特性、耐鹽能力和運(yùn)動(dòng)能力的分析，顯示了分散生長對(duì)粘球菌的營養(yǎng)細(xì)胞和粘