Myxococcus xanthus胞外基質(zhì)及其對(duì)細(xì)胞行為的影響.pdf

1、黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)屬于變形細(xì)菌的δ分枝，具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)、子實(shí)體分化發(fā)育和群體捕食行為等復(fù)雜的多細(xì)胞行為，并且能夠形成自然界最復(fù)雜的一類生物膜。在M.xanthus野生菌細(xì)胞表面分布了一層莢膜狀物質(zhì)，稱為胞外基質(zhì)(ECM)，是社會(huì)性運(yùn)動(dòng)(S運(yùn)動(dòng))所必需的，同時(shí)又構(gòu)成了子實(shí)體和生物膜的骨架結(jié)構(gòu)，對(duì)M.xanthus細(xì)胞在自然界的生存起到了至關(guān)重要的作用。M.xanthus的胞外基質(zhì)包含了基本等量的胞外多糖(EP

2、S)和蛋白質(zhì)，EPS形成了胞外基質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)，而蛋白分子依附在EPS骨架上，兩者共同組成了胞外基質(zhì)的主體結(jié)構(gòu)。M.xanthus胞外基質(zhì)除了與運(yùn)動(dòng)和發(fā)育相關(guān)外，還被認(rèn)為是細(xì)胞粘附聚集的物質(zhì)基礎(chǔ)，其EPS組分被認(rèn)為與M.xanthus在液體培養(yǎng)基中的聚團(tuán)生長特性相關(guān)。EPS缺失突變株的細(xì)胞在液體中能夠分散生長。然而，許多Myxococcus野生菌株在液體培養(yǎng)基中不能分散生長，而多以菌膜或菌團(tuán)的形式存在，這非常不利于實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)菌株的操作

3、。但是，目前關(guān)于液體生長條件下，EPS所行使的具體功能還沒有深入的研究。
　　 同時(shí)，許多細(xì)菌的生物膜中存在胞外DNA(ecDNA)，并被認(rèn)為是細(xì)菌胞外基質(zhì)的重要功能組分之一。己報(bào)道的關(guān)于ecDNA的功能有很多，例如為基因水平轉(zhuǎn)移提供遺傳物質(zhì)以及維持生物膜的整體穩(wěn)定性等。另外，對(duì)于ecDNA仍然還有很多的問題沒有解決，例如ecDNA整合到生物膜中的分子機(jī)制，如何與基質(zhì)中其他分子相互作用等，而且ecDNA的來源也仍然存在爭論。Ro

4、senbluh等人在M.xanthus細(xì)胞培養(yǎng)過程中利用同位素標(biāo)記DNA的方法來檢測細(xì)胞裂解，表明其胞外基質(zhì)中可能含有ecDNA，但是目前還沒有相關(guān)的研究進(jìn)展。
　　 與其復(fù)雜的生活周期相對(duì)應(yīng)，M.xanthus基因組大小為9.14Mb，比大多數(shù)己測序δ分支細(xì)菌基因組大得多，共包含了7333個(gè)蛋白編碼序列(CDS)。如此巨大的基因組除了來源于常見的基因倍增復(fù)制外，至少1.4Mb的部分是由基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)所產(chǎn)生的。而且，分析

5、與子實(shí)體形成相關(guān)基因的進(jìn)化史，發(fā)現(xiàn)其中22％的序列表現(xiàn)出了不同的密碼子偏好性，這是HGT發(fā)生的另一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)方面的證據(jù)。自然條件下細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移方式，除了接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還包括在革蘭氏陰性及陽性菌中均廣泛存在的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。細(xì)菌可以通過自然轉(zhuǎn)化的方式來獲取和整合外源DNA，以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌間的基因交換。在細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化過程中存在諸多屏障，且在不同種群或菌株中，影響感受態(tài)形成的生長環(huán)境和調(diào)控因子也差別很大。因此，在研究某一特定菌株是否存在自然

6、轉(zhuǎn)化時(shí)，并沒有通用的固定方法。雖然在變形細(xì)菌其他分支大多具有自然轉(zhuǎn)化特性，但是之前還沒有關(guān)于M.xanthus自然轉(zhuǎn)化的報(bào)道。
　　 圍繞著胞外基質(zhì)的多種生物學(xué)功能，本論文分別從三個(gè)方面對(duì)胞外基質(zhì)與M.xanthus各種不同細(xì)胞行為間的關(guān)系進(jìn)行了研究：一是胞外基質(zhì)中ecDNA組分的特性及對(duì)細(xì)胞行為的影響，二是自然轉(zhuǎn)化特性及其與胞外基質(zhì)中EPS組分間的關(guān)系，三是EPS在液體生長條件下對(duì)細(xì)胞行為的作用。
　　 在本文的第一部

7、分中，我們對(duì)M.xanthus ecDNA的存在與分布、與EPS間的相互作用、對(duì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性的影響和來源等進(jìn)行了表征。首先利用濾膜-小室分離系統(tǒng)及染色分析方法證實(shí)了ecDNA在胞外基質(zhì)中的存在。以DK1622的生物膜和子實(shí)體為樣品，用SYTO9和SYTOX orange對(duì)其做復(fù)染后用CLSM檢測，發(fā)現(xiàn)ecDNA在胞外基質(zhì)中并不是隨機(jī)分布的，其在生物膜和子實(shí)體中分別形成了團(tuán)狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。從相對(duì)位置和結(jié)合能力兩個(gè)方面，分析了胞外基質(zhì)的另一

8、重要組分EPS和ecDNA之間的關(guān)系。將DK1622的生物膜和子實(shí)體用STYO9、STYOX orange和.Alexa633-WGA復(fù)染后觀察，并對(duì)得到的圖像進(jìn)行共定位定量分析。結(jié)果表明，在M.xanthus生物膜和子實(shí)體中，ecDNA的染色信號(hào)大多與EPS的染色信號(hào)重疊在一起。同時(shí)，選擇DK1622基因組和鮭魚精子DNA兩種不同的DNA，通過檢測其在不同pH下與EPS的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)DNA與EPS間確實(shí)有相互吸附作用，并且該相互作用

9、不依賴于DNA的序列和大小，但卻受pH的影響。ecDNA正是通過與EPS間的相互作用而粘附在M.xanthus的細(xì)胞表面。
　　 研究了ecDNA對(duì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性的影響。向DK1622生物膜中添加DnaseⅠ后，發(fā)現(xiàn)其生物量減少了約20％，同時(shí)對(duì)SDS的抵抗力和機(jī)械強(qiáng)度均減弱了；且AFM的檢測結(jié)果也表明經(jīng)DnaseⅠ處理后的生物膜表面粘附力也比正常生物膜明顯減弱。由此，推測ecDNA作為胞外基質(zhì)的重要組分之一，在與胞外基質(zhì)中的其

10、他組分具有復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)的同時(shí)，對(duì)維持胞外基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度和粘附力也具有非常重要的作用。
　　 最后，在確定了ecDNA在胞外基質(zhì)內(nèi)的分布和生物學(xué)特性后，進(jìn)一步研究了ecDNA的來源及其與生物膜內(nèi)死細(xì)胞間的關(guān)系。將GFP表達(dá)突變株DK10547的生物膜和子實(shí)體用STYOX orange和細(xì)胞膜染料FM4-64復(fù)染后用CLSM檢測，發(fā)現(xiàn)在早期生物膜和子實(shí)體中ecDNA的紅色信號(hào)和死細(xì)胞之間并沒有明顯的重疊；另外，定量分析不同時(shí)間點(diǎn)的

11、一系列圖像信號(hào)后發(fā)現(xiàn)，在早期生物膜內(nèi)ecDNA的濃度曲線是逐漸上升。這些結(jié)果均表明在M.xanthus中除了細(xì)胞自溶外，還存在其他產(chǎn)生ecDNA的途徑。通過濾膜-小室方法提取ecDNA后，分別擴(kuò)增在基因組上位置不同的七個(gè)基因，全陽性的擴(kuò)增結(jié)果表明組成ecDNA的序列是無規(guī)則而沒有特異性的。進(jìn)而對(duì)各突變株的ecDNA產(chǎn)量做分析后，結(jié)果提示在M.xanthus中可能存在需能的ecDNA主動(dòng)分泌過程，并且這一過程依賴于通道蛋白PilQ。

12、>　　 在本文的第二部分中，以pZJY41為供體DNA，嘗試研究不同EPS突變株的自然轉(zhuǎn)化能力，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究影響自然轉(zhuǎn)化發(fā)生的各種因素。根據(jù)EPS能夠結(jié)合DNA的特性提出一個(gè)假設(shè)：EPS可能影響了M.xanthus潛在的自然轉(zhuǎn)化。經(jīng)過多種嘗試，成功在EPS缺失突變株中實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化，但是同樣條件下處理野生菌卻沒有得到轉(zhuǎn)化子，這些結(jié)果提示EPS可能是抑制M.xanthus自然轉(zhuǎn)化發(fā)生的胞外屏障。同時(shí)，所發(fā)現(xiàn)的M.xant

13、hus能夠在特定條件發(fā)生自然轉(zhuǎn)化，是變形細(xì)菌δ分枝中的首例，從進(jìn)化學(xué)方面支持此同源類群的進(jìn)化祖先本身可能擁有自然轉(zhuǎn)化的特性。
　　 通過嘗試各種不同類型供體DNA，發(fā)現(xiàn)只有以自主復(fù)制質(zhì)粒pZJY41做供體時(shí)才能發(fā)生有效地自然轉(zhuǎn)化，這可能是因?yàn)槠渥陨砟軌蛟贛.xanthus中獨(dú)立復(fù)制，而不必如其他類型供體DNA需要與基因組整合后方可穩(wěn)定存在。且來自M.xanthus的pZJY41比來自E.coli的效率要高約600倍，這表明M.x

14、anthus的限制修飾體系可能是自然轉(zhuǎn)化發(fā)生的另一胞內(nèi)屏障。依次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了M.xanthus無細(xì)胞提取液(CFE)的核酸酶活性和基因組的甲基修飾特性。然后，將各種類型供體DNA做CFE甲基修飾化處理，結(jié)果修飾后的質(zhì)粒表現(xiàn)出與基因組相似的甲基修飾特性，可以抵抗部分核酸酶的剪切，而且修飾后的定點(diǎn)整合質(zhì)粒pSWU19和pZJY41具有比修飾前更高的轉(zhuǎn)化效率。
　　 以得到的具有最高轉(zhuǎn)化效率的供受體條件為基礎(chǔ)，研究了影響 M.xant

15、hus自然轉(zhuǎn)化過程的一些生理學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期的菌體具有最高的轉(zhuǎn)化效率，即感受態(tài)細(xì)胞很可能在此階段形成；該細(xì)胞與供體DNA在MMC固體上共培養(yǎng)時(shí)間為7 d時(shí)得到的效率最高，而在CYE上共培養(yǎng)則無轉(zhuǎn)化子，說明了饑餓誘導(dǎo)條件及較長的培養(yǎng)時(shí)間是該自然轉(zhuǎn)化過程所必需的。且SW810不能形成子實(shí)體，表明該轉(zhuǎn)化過程與發(fā)育無關(guān)，但通過添加不同濃度的離子，發(fā)現(xiàn)Mg2+是其必需的。最后，通過檢測UV照射和熱處理后的轉(zhuǎn)化效率，我們發(fā)現(xiàn)壓力

16、條件與感受態(tài)誘導(dǎo)之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)。
　　 盡管對(duì)M.xanthus感受態(tài)形成的誘導(dǎo)和調(diào)控機(jī)理還不清楚，但是我們的結(jié)果表明部分TFP系統(tǒng)組分與DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)。首先，在分泌通道蛋白PilQ及其聚合所必需的Tgl蛋白缺失突變株中，自然轉(zhuǎn)化被完全抑制了。其次，為PilA聚合提供能量的PilB，其缺失突變株的轉(zhuǎn)化率明顯降低了；對(duì)菌毛由細(xì)胞質(zhì)膜向外延伸具有重要作用的膜蛋白PilC，其突變株的自然轉(zhuǎn)化率是降低的。
　　 在本文

17、的第三部分中，研究了液體培養(yǎng)條件下EPS的合成對(duì)M.xanthus營養(yǎng)細(xì)胞生長、抗逆性及穩(wěn)定期恢復(fù)生長的影響。首先，表征了各EPS相關(guān)突變株在液體培養(yǎng)基中的表型，發(fā)現(xiàn)EPS能夠提高液體中細(xì)胞的存活能力，EPS+菌株在液體中培養(yǎng)12d后，仍有活細(xì)胞存在，而EPS-菌株在培養(yǎng)6d后，細(xì)胞就基本喪失了活性。EPS同時(shí)又是細(xì)胞聚集和形成菌團(tuán)的關(guān)鍵因子，且EPS過量表達(dá)菌株產(chǎn)生的菌團(tuán)更多，細(xì)胞凝集現(xiàn)象也約明顯。其次，通過原位染色觀察，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)

18、基中形成的由EPS包裹的菌團(tuán)，其結(jié)構(gòu)與生物膜非常相似，代謝活性細(xì)胞均被包埋在EPS網(wǎng)絡(luò)中。而且，菌團(tuán)中的細(xì)胞在生理上也與生物膜中的細(xì)胞類似，對(duì)外界壓力有一定的耐受性。再次，通過EPS缺陷菌株與EPS+菌株進(jìn)行混合共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)液中EPS缺陷菌株的細(xì)胞存活能力和抗逆性均有所增強(qiáng)。原位染色表明EPS-細(xì)胞可以整合到EPS+菌株的菌團(tuán)內(nèi)部，而被來EPS所保護(hù)。最后，菌團(tuán)細(xì)胞恢復(fù)生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然EPS過少不利于細(xì)胞長時(shí)間在液體中