明綠豆中PAL、SOD的研究及L-SOD的制備.pdf

1、明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠，粒大皮薄、湯清易爛，清香可口等特點，質量為全國之冠，被稱為“明綠”，曾經被作為貢品。2008年明光綠豆被列為“國家地理標志保護產品”[1]。我國對綠豆的研究長期以來都主要集中種植上，對其基礎特性、功能特性、綜合利用及深度開發(fā)缺乏系統(tǒng)深入的研究，采用高新技術對原料進行深度開發(fā)的成果也尚不多見。
　　本文以明光綠豆為原料，對其基本成分進行了測定；通過采用飽和硫酸銨分級沉淀、透析脫鹽、DE-52陰離子交換層析等

2、步驟對苯丙氨酸解氨酶(PAL)進行分離純化，并對其基本酶學性質和金屬離子及氨基酸等外界因子的影響進行初步的探索；利用Plackett-Burman設計及響應面法優(yōu)化超聲輔助提取明綠豆超氧化物歧化酶(SOD)，通過采用飽和硫酸銨分級沉淀、透析脫鹽、Sephadex G-75分子篩層析等步驟對SOD進行分離純化并初步探究了SOD的基本酶學性質；同時，響應面優(yōu)化了SOD脂質體的制備工藝，并初步研究了脂質體包封后SOD的穩(wěn)定性等。為明綠豆的綜合

3、利用以及其功能性成分的進一步開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。主要研究結果如下：
　　1.明綠豆基本成分測定結果如下：
　　(1)明綠豆基本成分含量：水分為11.82％，粗淀粉為53.25%，粗蛋白為25.26%，粗脂肪為0.90%，灰分為3.70%；
　　(2)明綠豆中必需氨基酸含量：纈氨酸為22.57 mg/g，蘇氨酸16.63 mg/g，蛋氨酸5.94 mg/g，異亮氨酸18.21 mg/g，亮氨酸38.00 mg/g，

4、苯丙氨酸28.50 mg/g，賴氨酸35.23 mg/g；蘇氨酸為明綠豆的第1限制氨基酸；
　　(3)明綠豆中礦物質含量：Ca47.76 mg/kg，Cu0.54 mg/kg，F(xiàn)e1.94 mg/kg，Zn2.09 mg/kg，K576.69 mg/kg，Mn0.79 mg/kg；
　　2.明綠豆PAL最佳分離純化條件為：PAL洗脫液pH值為8.8，最佳離子強度為0.4 mol/L氯化鈉。PAL的純化倍數(shù)為6.9829，蛋白

5、質得率為4.65%，酶得率為32.45%。
　　3.明綠豆PAL基本性質的研究：
　　(1)PAL在硼砂-硼酸緩沖溶液中適宜的pH范圍為7.6~9.0，最適pH有2個：8.0和8.6。
　　(2)PAL最適溫度范圍為35～45℃，最適反應溫度為40℃。超過70℃則被鈍化。
　　(3)得到PAL的兩個Km值，分別是：Km1為6.94×10-5 mol/L，Km2為1.23×10-4 mol/L。經SDS-PAGE鑒

6、定為兩條蛋白質區(qū)帶，其亞基分子量分別為52 KD，57 KD。
　　(4)L-酪氨酸、L-半胱氨酸、組氨酸和肉桂酸對PAL活性都有抑制作用，抑制程度隨抑制劑不同而不同。L-胱氨酸對PAL的活性無影響。
　　4.明綠豆SOD最佳提取條件：采用液固比22（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH7、超聲功率140 W、超聲時間20 min，超聲水浴溫度44℃、水浴浸提時間1.5 h、水浴浸提溫度60℃的組合，明綠豆SOD的實際比活力為856

7、.95 U/mg。
　　5.明綠豆SOD的分離純化：SOD的最佳鹽溶條件為35%硫酸銨，最佳鹽析條件為85％硫酸銨；經過一系列分離純化，明綠豆SOD的純化倍數(shù)為29.93，蛋白質得率為4.65%，酶得率為46.62%。
　　6.明綠豆SOD的基本性質：明綠豆SOD對酸具有一定的穩(wěn)定性，最適pH范圍為6～8；明綠豆SOD具有一定的熱穩(wěn)定性，最適溫度范圍為40～60℃，最適溫度為60℃。
　　7.明綠豆SOD脂質體最佳制備

8、工藝參數(shù)：脂膽比2.1（mL/g）、類脂濃度為21 mg/L、有機相與水相體積比為4.1(mL/mL)。在此最優(yōu)條件下SOD脂質體包封率達88.73%。
　　8.SOD脂質體（L-SOD）穩(wěn)定性研究：累積釋放12 h時，SOD的釋放度為77%；24 h時，SOD的釋放度為95%。80℃水浴恒溫150 min L-SOD的相對活力為90%，游離的SOD僅為2%。經胃蛋白酶在37℃作用10 min后，游離SOD的活性殘留5.2%，L-