紅曲菌肉品發(fā)酵菌株篩選、鑒定及其酸性蛋白酶功能特性研究.pdf

1、紅曲菌(Monascus spp.)是我國(guó)重要的食用微生物資源，將其及其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于發(fā)酵食品可顯著改善產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史。紅曲菌生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生紅曲色素(Monascus pigments，MPs)、莫納可林K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸、dimerumic acid以及一些有機(jī)酸和蛋白酶等，其中MPs能顯著改善食品色澤，蛋白酶等是發(fā)酵食品風(fēng)味形成的關(guān)鍵因素。關(guān)于紅曲菌的應(yīng)用研究主要集中在植物源發(fā)酵

2、食品的生產(chǎn)，將紅曲菌作為肉品發(fā)酵劑的研究較少，僅在紅曲菌代謝產(chǎn)物如MPs、dimerumic acid等對(duì)發(fā)酵肉制品品質(zhì)及功能方面的影響有報(bào)道。為更好地將紅曲菌及其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的加工，本研究開展紅曲菌肉品發(fā)酵菌株篩選，對(duì)其所產(chǎn)酸性蛋白酶組分進(jìn)行分離、純化和酶學(xué)特性研究，并探討該酸性蛋白酶組分對(duì)肌肉蛋白的降解規(guī)律及對(duì)肌肉品質(zhì)的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.紅曲菌肉品發(fā)酵菌株優(yōu)選及鑒定
　　對(duì)12株不同種屬

3、的紅曲菌在不同純培養(yǎng)條件下(PDB液態(tài)培養(yǎng)基、米飯固態(tài)培養(yǎng)基)進(jìn)行初篩，以液態(tài)培養(yǎng)物中色素含量、酸性蛋白酶酶活和固態(tài)培養(yǎng)物中桔霉素含量為檢測(cè)指標(biāo)，篩選到產(chǎn)色素和酸性蛋白酶能力較強(qiáng)，且不產(chǎn)或低產(chǎn)桔霉素的2株紅曲菌M J-1和As3.549。模擬肉品加工條件構(gòu)建體外篩選體系對(duì)初篩菌株進(jìn)行優(yōu)選，以培養(yǎng)物中菌絲體干重、色素含量、發(fā)酵液pH值和酸性蛋白酶酶活為考察指標(biāo)，對(duì)M J-1和As3.549進(jìn)行肉品發(fā)酵菌株優(yōu)選，結(jié)果表明:2株紅曲菌在25～

4、50 g/L的NaCl、0.1～0.3 g/L的NaNO2、1～5 g/L的多聚磷酸鈉含量和以葡萄糖或蔗糖為碳源的系列培養(yǎng)物中，M J-1的菌絲體干重、色素產(chǎn)量和酸性蛋白酶酶活均顯著高于As3.549(p＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，M J-1對(duì)肉品加工條件的耐受性優(yōu)于As3.549，是理想的紅曲菌肉品發(fā)酵菌株。采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS序列分析的方法對(duì)MJ-1進(jìn)行鑒定，MJ-1的ITS、ITS1及ITS2序列的聚類分析顯示，MJ-1序列均能與

5、紅色紅曲菌（Monascus ruber）聚在一起，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定M J-1為紅色紅曲菌。
　　2.紅色紅曲菌MJ-1對(duì)發(fā)酵豬肉糜品質(zhì)的影響
　　將MJ-1接種豬肉糜發(fā)酵，跟蹤測(cè)定豬肉糜發(fā)酵過(guò)程中色澤、TBARs、TVBN、蛋白酶酶活、MFI、FAA和肌肉蛋白SDS-PAGE電泳等指標(biāo)的變化，并利用HPLC和 LC-MS對(duì)發(fā)酵結(jié)束豬肉糜內(nèi)桔霉素、生物胺含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明:接種MJ-1的豬肉糜發(fā)酵過(guò)程中a*值、M

6、FI值、FAA總量和酸性蛋白酶酶活均顯著上升(p＜0.05)，TBARs值顯著下降(p＜0.05)，TVBN值上升較慢(p＞0.05)，發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到最高值(6.82 mg/100 g豬肉糜)，仍在新鮮標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)(≤25 mg/100 g)，SDS-PAGE電泳表明豬肉糜發(fā)酵過(guò)程中肌肉蛋白發(fā)生了明顯降解。在發(fā)酵結(jié)束的豬肉糜中未檢測(cè)到桔霉素，總生物胺含量達(dá)到79.26 mg/100 g，毒性較大的組胺和酪胺分別為4.12 mg/100g、3.

7、68mg/100g，均低于FDA標(biāo)準(zhǔn)。上述結(jié)果說(shuō)明:接種MJ-1發(fā)酵能顯著改善豬肉糜色澤，抑制脂肪氧化和腐敗，促進(jìn)肌肉蛋白降解和FAA生成。在發(fā)酵結(jié)束豬肉糜中未檢測(cè)到桔霉索，生物胺總量、組胺和酪胺含量均在安全范圍內(nèi)，因此將M J-1用于肉品加工中是安全的。
　　3.紅色紅曲菌M J-1酸性蛋白酶分離、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B離子交換和Sephacryl S-200分子篩凝膠過(guò)濾層析，

8、從紅色紅曲菌M J-1粗酶液中分離、純化到1種酸性蛋白酶組分，比活力達(dá)到58.57 U/μg，純化了12.28倍，酶活回收率為5.13％。SDS-PAGE電泳表明該酸性蛋白酶分子量為51 KDa，且無(wú)亞基是單體酶。利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)該酸性蛋白酶進(jìn)行序列分析，該酶與紫色紅曲菌所產(chǎn)酸性蛋白酶(Accession number BAC97797.1)的同源性達(dá)到95％，有7段肽段匹配，匹配分值達(dá)到744分。圓二色譜結(jié)果顯示該酸性蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α

9、-螺旋占84.3％，無(wú)規(guī)卷曲占15.7％，不存在β-折疊和回轉(zhuǎn)，說(shuō)明該酸性蛋白酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較差。該酶在pH3.0，40℃時(shí)催化能力最強(qiáng)，在pH3.0～5.0，溫度30℃～50℃范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。以酪蛋白為底物對(duì)該酸性蛋白酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，確定該酶的Km和Vmax分為1.3 mg/mL、44.05μg/mL·min，說(shuō)明該酶對(duì)動(dòng)物源的酪蛋白有較強(qiáng)的底物親和力。Mn2+、Mg2+、2-巰基乙醇和DTT對(duì)該酶的酶活有較明顯的激活作用，

10、 Ag+、Fe3+、PMSF、EDTA和EGTA對(duì)酶活有較明顯的抑制作用，Cu2+、Ca2+，F(xiàn)e2+和Na+對(duì)酶活影響不明顯。
　　4.紅色紅曲菌M J-1酸性蛋白酶降解肌肉蛋白規(guī)律及對(duì)肌肉品質(zhì)的影響
　　通過(guò)SDS-PAGE電泳考察MJ-1酸性蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的降解情況，結(jié)合該酶處理的肌肉組織掃描電鏡結(jié)果，研究該酶對(duì)肌肉蛋白的降解規(guī)律。對(duì)比MJ-1酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后的肌肉組織肌纖維直徑

11、、MFI值、肌肉剪切力和肌肉組織加壓失水率等指標(biāo)的差異，進(jìn)一步研究MJ-1酸性蛋白酶對(duì)肌肉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明:肌原纖維蛋白中190 KDa的重鏈肌球蛋白條帶在酶解30 min后完全消失，43 KDa處肌動(dòng)蛋白及其以下的蛋白條帶在酶解10 min時(shí)開始變?nèi)?，但在酶解過(guò)程中沒(méi)有消失，97.4 KDa處在酶解10 min后出現(xiàn)新的條帶，且隨著酶解時(shí)間延續(xù)不斷增強(qiáng);肌漿蛋白在整個(gè)酶解過(guò)程中沒(méi)有變化;掃描電鏡下酶解后的肌肉組織橫截面變疏松，有大