HPV16E7-11-20-HSP110復(fù)合物的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、目的：
　　 1．利用大腸桿菌Rosetta2(DE3)表達鼠熱休克蛋白(heatshockprotein)110，為復(fù)合物的構(gòu)建提供實驗基礎(chǔ)。
　　 2．利用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)16型E7抗原的人白細胞抗原A2分子限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位（第11-20位氨基酸）及其標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC

2、)的E711.20，同樣是為復(fù)合物的構(gòu)建提供實驗基礎(chǔ)。
　　 3．將純化的HSP110與肽E711-20在熱休克狀態(tài)下形成復(fù)合物，免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠，采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，檢測其細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷力，進一步探討該復(fù)合的免疫原性。為證明HSP110是否能提高抗原肽E711-20的免疫原性，為高危型HPV16感染預(yù)防性疫苗和治療性疫苗的研制提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　

3、1．用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Westernblot)鑒定mHSP110蛋白表達。
　　 2．采用異硫氫酸熒光索(FITC)標(biāo)記的E711-20肽及E711-20肽與mHSP110在熱休克狀態(tài)下結(jié)合，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)后，電泳膠在熒光成像儀下成像后，再將同一塊凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察條帶情況，從而

4、證明mHSP110與抗原肽的結(jié)合。
　　 3．將PBS，mHSP，E711-20，mHSP110-E711-20抗原肽復(fù)合物通過腹腔注釋，免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠，每組5只，于0、1、2周共注射3次。最后一次免疫后兩周，脫頸處死小鼠，無菌條件下獲得脾細胞，制備成效應(yīng)細胞。采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，檢測其細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷力。
　　 結(jié)果：
　　 1．經(jīng)過SDS-PAGE和Weste

5、rnblot鑒定出了mHSP110的正確表達。
　　 2．合成的候選表位多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析，合成肽的純度均大于90％，用FITC標(biāo)記的E711.20肽證明了該復(fù)合物連接成功。
　　 3．MHSP110-E711.20抗原肽復(fù)合物免疫小鼠后，該復(fù)合物能誘導(dǎo)出腫瘤特異性的CTL。復(fù)合物組的脾細胞在效靶比分別為12.5:1；25:1；50:1對T2細胞的殺傷率分別為(4.530±0.610)％、(21.780±

6、1.716)％、(48.220±1.227)％，明顯高于相對應(yīng)的PBS組的(1.227±0.202)％、(2.113±0.192)％、(3.473±0.246)％;HSP110組的(1.336±0.322)％、(2.150±0.445)％、(3.987±4.497)％;E711.20組的(1.863±0.489)％、(3.800±0.700)％、(5.563±1.093)％;復(fù)合物組與其他三組分別比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)

7、；其他三組相互比較，差異無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功表達和純化了熱休克蛋白110。
　　 2．通過標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案成功合成了多肽E711-20，及熒光標(biāo)記肽FITC-Ahx-E711.20。HSP110在熱休克狀態(tài)下以非共價形式成功連接了E711-20。
　　 3．重組表達的mHSP110在一定條件下可以在體外與抗原肽E711-20形成復(fù)合物，且該復(fù)合物的免疫原性明顯