海產(chǎn)品沙門氏菌污染的監(jiān)控與溯源技術(shù)研究.pdf

1、沙門氏菌為一種重要的食源性致病菌，是造成許多國家發(fā)生食源性細菌性腸炎的主要原因之一。全球每年約有1600萬由沙門氏菌所引起的感染病例，其中死亡病例60萬。為保障人類食品衛(wèi)生安全，減少因沙門氏菌污染帶來的巨額經(jīng)濟損失，建立沙門氏菌快速檢測方法及開展溯源性研究迫在眉睫。本研究通過開展海產(chǎn)品中沙門氏菌的熒光定量PCR快速檢測、基于多位點序列分型方法的溯源性分析和沙門氏菌耐藥性研究，為海產(chǎn)品中沙門氏菌的防控提供重要技術(shù)支撐，因而具有十分重要的社

2、會和經(jīng)濟意義。
　　本研究的主要內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.海產(chǎn)品中沙門氏菌熒光定量PCR技術(shù)的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)沙門氏菌屬特異性基因Ompc設(shè)計1對引物和TaqMan探針，優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，最終建立適合于海產(chǎn)品中沙門氏菌快速檢測的熒光定量PCR方法。
　　(1)特異性:用熒光定量PCR方法對實驗中所用的32株菌株（包括腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、大腸桿

3、菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單核細胞增多性李斯特菌等）進行檢測，其中沙門氏菌屬菌株的檢測結(jié)果均為陽性，而非沙門氏菌屬菌株的檢測結(jié)果均為陰性。表明本研究建立的熒光定量PCR方法具有高特異性。
　　(2)靈敏性:將本研究制備的沙門氏菌Ompc陽性重組質(zhì)粒以1∶10倍比稀釋，以此為模板進行熒光定量PCR擴增，檢測結(jié)果表明該方法的檢出下限為每μL1×101拷貝數(shù)，表明本研究建立的熒光定量PCR方法靈敏度高。
　　對舟山水產(chǎn)品加

4、工廠和舟山菜市場的120份樣品采用熒光定量PCR方法和國標法進行檢測，檢測結(jié)果一致，均檢出12株沙門氏菌，檢出率為10.0％。利用建立的熒光定量PCR檢測方法再對市場所售的新鮮豬肉200份進行檢測，其中包括常溫鮮豬肉50份，冷鮮豬肉150份。同時用國標法進行檢測驗證，其檢測結(jié)果與熒光定量方法相一致。其中常溫鮮豬肉中檢出了4份，檢出率為8％(4/50)，冷鮮豬肉中檢出了17份，檢出率為11.3％(17/150)，總檢出率為10.5％(21

5、/200)。
　　2.海產(chǎn)品中沙門氏菌的多位點序列分型技術(shù)的研究dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA，對不同來源的海產(chǎn)品沙門氏菌分離株進行多位點序列分型，并使用DNA star.Lasergene.v7.1軟件對46株分離株進行分析，初步探明各菌株間的親緣關(guān)系，并闡明舟山地區(qū)沙門氏菌流行序列型。結(jié)果表明46株沙門氏菌分離株共可分為20個序列型。其中優(yōu)勢序列型為ST11，共12株占總數(shù)的26.1％(12/46)

6、，其次為ST34，共5株占總數(shù)的10.9％(5/46)，ST155共4株占總數(shù)的8.7％(4/46)，序列型ST14和ST19，均為3株占總數(shù)的6.5％(3/46)，序列型ST46、ST64、ST185和ST1500各2株，占總數(shù)的4.4％(2/46)。ST29、ST106、ST197、ST203、ST413、、ST1291、ST1542、ST1561、ST1808、ST1809和ST1810各1株，占2.2％(1/46)。新發(fā)現(xiàn)3個序

7、列型分別是ST1808、ST1809和ST1810。
　　3.海產(chǎn)品中沙門氏菌的耐藥性研究
　　采用Vitek2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對46株海產(chǎn)品沙門氏菌分離株耐藥性進行檢測，對常用的18類抗生素的耐藥狀況進行分析。藥敏結(jié)果顯示分離株具有較為嚴重的耐藥及多重耐藥現(xiàn)象，其中對頭孢唑啉、頭孢替坦、阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素的耐藥率最高，為100.0％。其次為呋喃妥因(73.9％)、氨芐西林(39.1％)

8、、氨芐西林/舒巴坦(39.1％)，復方新諾明(17.4％)，環(huán)丙沙星(4.3％)，左旋氧氟沙星(2.2％)，頭孢他啶(2.2％)和頭孢曲松(2.2％)。所有沙門氏菌分離株對厄他培南和亞胺培南藥物均敏感。值得關(guān)注的是本研究檢測到了氟喹諾酮和三代頭孢的耐藥菌株。在分離株的多重耐藥中，6重耐藥菌株所占比例最大，占34.4％(16/46)，其次為5重耐藥菌株，占26.1％(12/46)。多重耐藥率（同時對≥2種抗生素耐藥）達到100％。這些結(jié)果