核酸適配體介導(dǎo)的載有阿霉素的DNA四面體對(duì)MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用.pdf

1、目的:
　　化療是晚期腫瘤的主要治療手段，但傳統(tǒng)化療藥物的細(xì)胞毒性作用往往會(huì)引起全身的系統(tǒng)毒性反應(yīng)，降低患者的耐受程度，導(dǎo)致治療效果下降。靶向治療作為一種可以與腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療手段，是克服傳統(tǒng)化療系統(tǒng)毒性的重要技術(shù)路徑之一。MUC1是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細(xì) 胞中過(guò)量表達(dá)，包括乳腺癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，胰腺癌，卵巢癌等。MUC1在腫瘤的生長(zhǎng)，代謝，轉(zhuǎn)移等方面也有一定的作用。除此之外在腫瘤細(xì)胞中

2、表達(dá)的MUC1的結(jié)構(gòu)與正常組織細(xì)胞中表達(dá)的MUC1不同，其糖基化程度較低，因此使得MUC1成為了一種具有一定腫瘤特癥性的靶標(biāo)分子，為其在靶向治療的應(yīng)用中提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究表明，針對(duì)MUC1的單克隆抗體、疫苗、小分子配體等手段在體外和體內(nèi)的腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中，可取得一定的初步效果，但目前MUC1靶向治療的臨床轉(zhuǎn)化依然十分遙遠(yuǎn)，因此有必要探索針對(duì)MUC1的新型靶向治療方法。核酸適配體（aptamer）是一類由寡聚核苷酸組成的具有高特異

3、性和親和性的小分子配體。與抗體相比，核酸適配體具有較低的免疫原性和較強(qiáng)的組織穿透性，并且制備過(guò)程簡(jiǎn)便，因此具有極大應(yīng)用前景。DNA正四面體(Td)作為一種DNA納米結(jié)構(gòu)，其自組裝的特點(diǎn)使得該物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、容易被功能性基團(tuán)修飾的優(yōu)勢(shì)。已有研究表明，DNA正四面體可以作為一種藥物載體，可負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin，或Dox)。然而，目前尚未有研究報(bào)道將核酸適配體與DNA正四面體相偶聯(lián)構(gòu)建成為靶向藥物呈遞系

4、統(tǒng)。本研究通過(guò)將MUC1核酸適配體(Apt)與DNA正四面體相偶聯(lián)，構(gòu)建成為靶向性的阿霉素呈遞系統(tǒng)，并且在體外評(píng)估了該靶向載體是否能夠與MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合，以及是否能靶向性地對(duì)MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
　　方法:
　　利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，通過(guò)自組裝的方式，構(gòu)建出DNA正四面體以及與MUC1 aptamer相偶聯(lián)后的Apt-Td。通過(guò)用FAM熒光染料標(biāo)記Apt-Td，利用流式細(xì)胞分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)Apt-T

5、d是否可以特異性的與MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞結(jié)合。通過(guò)物理方法，將阿霉素載入DNA納米結(jié)構(gòu)，構(gòu)建成為載有阿霉素的DNA納米結(jié)構(gòu)(Apt-Dox，Td-Dox，Apt-Td-Dox)，評(píng)估其載藥率，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用共聚焦成像技術(shù)，流式細(xì)胞分析技術(shù)以及細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)驗(yàn)證Apt-Td-Dox在體外是否可以將阿霉素靶向呈遞給MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，并且通過(guò)MTS法測(cè)定Apt-Td-Dox在MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞與MUC1陰性對(duì)照細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。

6、
　　結(jié)果:
　　本實(shí)驗(yàn)利用MUC1 aptamer和DNA正四面體通過(guò)自組裝的方式成功構(gòu)建了目標(biāo)藥物載體Apt-Td，并對(duì)其進(jìn)行了粒徑和Zeta電位的表征，Apt-Td的平均粒徑大小為12.38nm，其Zeta電位為-10.mV;流式細(xì)胞分析結(jié)果表明Apt-Td與本實(shí)驗(yàn)所采用的游離MUC1 aptamer類似，可以選擇性地與MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞結(jié)合而基本不與MUC1陰性細(xì)胞結(jié)合;通過(guò)對(duì)三種DNA納米結(jié)構(gòu)載藥率的研究發(fā)現(xiàn)，A

7、pt-Td的載藥率是游離aptamer載藥率的25倍;細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明Apt-Td-Dox可以將阿霉素靶向呈遞至MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞而限制阿霉素在MUC1陰性細(xì)胞中的藥物積累;細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，Apt-Td-Dox對(duì)MUC1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性，并同時(shí)降低阿霉素對(duì)MUC1陰性細(xì)胞的毒性(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　利用MUC1 aptamer和DNA正四面體可構(gòu)建成具有靶向作用的藥物載體Apt-Td。體外