豬IL-4對(duì)PRRSV免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用及抗原表位修飾功能分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，該病主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬呼吸障礙。我國(guó)于1996年首次報(bào)道此病;2006年爆發(fā)由傳統(tǒng)毒株變異而引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)流行，該病在各種年齡豬群中的發(fā)病率和死亡率都大幅升高，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大損失。
　　當(dāng)前，商業(yè)化疫苗的免疫

2、保護(hù)力依然存在諸多問(wèn)題:PRRSV減毒活疫苗(Modified live-PRRSV vaccine，MLV)在一定范圍內(nèi)效果較好，但因?yàn)椴《净蚪M變異頻繁而導(dǎo)致疫苗具有很強(qiáng)的毒株特異性，故該疫苗不能對(duì)變異流行毒株達(dá)到全面的免疫保護(hù);PRRSV滅活疫苗（Inactivated-PRRSV vaccine，Ⅳ）的免疫原性較弱，幾乎沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用效果。在病毒感染的早期階段（感染后7-9d）機(jī)體可以檢測(cè)到強(qiáng)烈的抗PRRSV抗體反應(yīng)，這些抗體是N

3、蛋白特異的非中和性抗體(Non-neutralizing antibody，Non-NA)，它們不能阻斷病毒的感染，相反還與病毒的抗體依賴性增強(qiáng)作用(ADE)密切相關(guān)。抗PRRSV中和性抗體(Neutralizing antibody，NA)在阻止病毒感染方面扮演重要角色，然而PRRSV特異性中和性抗體的產(chǎn)生被極大地推遲，它們?cè)诟腥净蛎庖吆?～4周才可被檢測(cè)到但效價(jià)較低、維持時(shí)間較短。同時(shí)，PRRSV感染后豬體內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平起

4、伏不定，其中白細(xì)胞介素4(SwIL-4)在感染早期表達(dá)量低、幾乎難以檢測(cè)，中后期的表達(dá)量和PRRSV特異性IL-4分泌細(xì)胞變化頻率不大。因此，使動(dòng)物機(jī)體中和性抗體產(chǎn)生時(shí)間提前、抗體滴度提高并且維持時(shí)間延長(zhǎng)，是提高PRRSV疫苗效力的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
　　本文研究了SwIL-4對(duì)PRRSV ORF5核酸疫苗和減毒活疫苗(MLV)誘導(dǎo)機(jī)體免疫免疫應(yīng)答反應(yīng)與免疫保護(hù)的調(diào)控作用;同時(shí)對(duì)PRRSV GP5誘餌性表位A定點(diǎn)突變產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)

5、行了初步探討。
　　為初步確定SwIL-4對(duì)PRRSV免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，本課題首先進(jìn)行了PRRSVORF5與SwIL-4的核酸疫苗試驗(yàn)。通過(guò)基因工程方法克隆表達(dá)PRRSV GP5重組蛋白，以此為包被抗原建立檢測(cè)抗GP5抗體效價(jià)的間接酶聯(lián)免疫吸附方法(iELSIA)，該方法與Western blot檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)93.16％。基因重組獲得ORF5與SwIL-4的真核表達(dá)質(zhì)粒，包括pVAX1-ORF5、pVAX1-IL-4、pV

6、AX1-ORF5-IL-4。BALB/c小鼠免疫接種42d后，pVAX1-ORF5+pVAX1-IL-4組外周血抗GP5抗體水平與血清中和效價(jià)均顯著高于其他三個(gè)組(pVAX1-ORF5、pVAX1-ORF5+pVAX1和pVAX1-ORF5-IL-4);56dpi時(shí)接種pVAX1-ORF5-IL-4組高于另外兩個(gè)組，但是顯著低于pVAX1-ORF5+pVAX1-IL-4組。小鼠試驗(yàn)顯示，真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ORF5免疫接種能夠誘導(dǎo)小

7、鼠產(chǎn)生抗GP5蛋白的抗體，同時(shí)接種SwIL-4在一定程度上增強(qiáng)了機(jī)體針對(duì)PRRSV GP5的免疫應(yīng)答反應(yīng)。兩種真核質(zhì)粒pVAX1-ORF5與pVAX1-IL-4同時(shí)分開(kāi)免疫接種誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)顯著高于串聯(lián)體表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ORF5-IL-4。
　　本課題進(jìn)一步研究了SwIL-4在豬體內(nèi)對(duì)PRRSV免疫應(yīng)答的調(diào)控作用，分別進(jìn)行PRRSV ORF5與SwIL-4核酸疫苗和減毒活疫苗與SwIL-4質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)對(duì)豬的免疫

8、保護(hù)試驗(yàn)。間接ELISA（PRRSV GP2，GP3，GP4，GP5和M蛋白包被）檢測(cè)豬外周血抗PRRSV膜蛋白抗體效價(jià)。豬免疫接種35d后，MLV+pVAX1-IL-4與MLV+Pr.IL-4二組抗PRRSV膜蛋白抗體水平均顯著高于另外兩個(gè)組(MLV，MLV+pVAX1)，而這二組之間無(wú)顯著性差異;42dpi至21dpc剖檢時(shí)，接種MLV+pVAX1-IL-4組抗PRRSV膜蛋白抗體效價(jià)顯著高于其他三個(gè)組。需要強(qiáng)調(diào)的是，HP-PRRS

9、強(qiáng)毒攻擊后所有組的抗體水平皆有下降，但接種MLV+pVAX1-IL-4組豬抗體水平迅速回升甚至高于攻毒前水平，然而其他三個(gè)組的抗體則一直處于較低水平未有升高。豬血清中和抗體效價(jià)具有與抗PRRSV膜蛋白抗體水平相同的變化趨勢(shì)。
　　流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中T淋巴細(xì)胞亞群百分含量。(1) CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量:42dpi，接種MLV+pVAX1-IL-4與MLV+Pr.IL-4二組CD3

10、+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量開(kāi)始明顯升高，顯著高于其他兩個(gè)組(MLV，MLV+pVAX1)，而該二組之間無(wú)顯著性差異。63dpi開(kāi)始，接種MLV+pVAX1-IL-4組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量出現(xiàn)明顯上升，顯著高于其他三個(gè)組。(2) CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量:免疫接種后至攻毒前，所有組的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量皆沒(méi)有明顯變化;強(qiáng)毒攻擊后MLV+pVAX1-IL-4組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量大幅下降

11、，顯著低于其他三個(gè)組。(3)CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比率:42dpi，接種MLV+pVAX1-IL-4與MLV+Pr.IL-4二組CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比率開(kāi)始明顯升高，顯著高于其他兩個(gè)組，而該二組之間無(wú)顯著性差異。強(qiáng)毒攻擊后，MLV+pVAX1-IL-4組CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比率大幅升高，與另三組比較差異極顯著。
　　建立鑒別并定量測(cè)定疫苗毒株(TJM

12、-F92)與攻毒毒株（HP-PRRSV SD-JN）的實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）方法，檢測(cè)豬外周血PRRS病毒載量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:7dpc，四個(gè)疫苗接種組對(duì)應(yīng)外周血病毒載量顯著低于PBS對(duì)照組;同時(shí)，接種MLV+pVAX1-IL-4組顯著低于另外三個(gè)疫苗接種組。14dpc，五個(gè)試驗(yàn)組的外周血病毒載量均出現(xiàn)大幅下降，但四個(gè)免疫接種組對(duì)應(yīng)的病毒載量顯著低于PBS組，而這四個(gè)組之間沒(méi)有顯著性差異。高致病性PRRSV大劑量接種(2.0×1

13、050 TCID50)后，單用MLV免疫接種的豬表現(xiàn)出溫和的發(fā)燒和食欲不振、嗜睡與被毛粗亂，剖檢未見(jiàn)明顯的肺臟病變;MLV與SwIL-4同時(shí)免疫接種的豬則幾乎沒(méi)有臨床癥狀，也未有肉眼可見(jiàn)的肺臟病變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，SwIL-4添加免疫組臨床癥狀與肺臟病變分?jǐn)?shù)顯著低于MLV單獨(dú)免疫接種組。
　　以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:試驗(yàn)豬在核酸疫苗或減毒活疫苗與SwIL-4同時(shí)免疫接種時(shí)，抗GP5或抗膜蛋白抗體水平、血清中和性效價(jià)均得到了顯著的提高;外周

14、血T淋巴細(xì)胞亞群呈現(xiàn)規(guī)律性變化，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞百分含量比值顯著升高，顯示機(jī)體的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)得到極大地增強(qiáng);外周血PRRS病毒載量(PRRSV loads)顯著低于其他免疫組;豬臨床癥狀及剖檢肺臟病變均顯著低于其他試驗(yàn)組。結(jié)果表明，兩種疫苗免疫分別在SwIL-4的作用下，試驗(yàn)豬針對(duì)PRRSV的免疫應(yīng)答反應(yīng)和由此產(chǎn)生的免疫保護(hù)力均得到了顯著地增強(qiáng)。該研究證明，SwIL-4在PRRSV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生“正?！钡拿庖邞?yīng)答反應(yīng)方面發(fā)

15、揮了極其重要的調(diào)控作用。
　　為進(jìn)一步研究如何提高機(jī)體抗PRRSV中和抗體水平，本課題對(duì)PRRSV誘餌性表位(Decoy epitope)A中的N30糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以探求該突變對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)以及對(duì)機(jī)體誘導(dǎo)抗GP5抗體產(chǎn)生的影響。本試驗(yàn)建立了定量測(cè)定ORF5基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR方法。檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后60h時(shí)間內(nèi)突變體ORF5基因的轉(zhuǎn)錄水平始終較低，其對(duì)應(yīng)的mRNA拷貝數(shù)小于5×107 log

16、10;而原序列ORF5基因的轉(zhuǎn)錄處于高水平，其mRNA拷貝數(shù)始終大于1×108 log10，二者差異極顯著;此突變使ORF5基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。Western blot進(jìn)行ORF5基因的體外蛋白表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體基因在細(xì)胞內(nèi)翻譯表達(dá)為兩種分子量大小不同的蛋白，其一與原GP5蛋白大小相同，另一條則分子量明顯變小。該試驗(yàn)表明，誘餌性表位的定點(diǎn)突變引起了GP5蛋白體外表達(dá)的顯著變化，推測(cè)原因是蛋白的糖基化水平變異導(dǎo)致蛋白分子

17、量改變;抑或糖基化水平變異使該蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而造成更多的蛋白抗原表位暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)。該誘餌性表位定點(diǎn)突變產(chǎn)生的生物學(xué)功能變化有待進(jìn)一步深入研究。
　　本研究表明，SwIL-4對(duì)PRRSV誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)揮了極其重要的調(diào)控作用;顯著增強(qiáng)了豬抗PRRSV體液免疫反應(yīng)，提高了PRRSV核酸疫苗和MLV對(duì)豬的免疫保護(hù)力。GP5誘餌性表位糖基化位點(diǎn)定點(diǎn)突變對(duì)基因的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和體外蛋白表達(dá)以及引致細(xì)胞死亡（或凋亡）產(chǎn)生