Dnase-I純化結合堿性裂解法提取混合斑精子DNA.pdf

1、性犯罪案件中最常見的生物學檢材為精液與陰道分泌液組成的混合斑。在法醫(yī)學檢驗鑒定中常需要進行混合斑的DNA檢驗,確定男性精子的個體來源從而偵破案件。精子DNA的提取是混合斑DNA檢驗的關鍵,提取DNA的量的多少和純度的優(yōu)劣直接決定著檢驗成功與否。目前主要采用差異裂解細胞的方法分離混合斑中的精子和陰道上皮細胞,然后通過有機法、Chelex-100法等分別提取陰道上皮細胞和精子細胞兩種成分的DNA進行分型鑒定。但這種方法費時費力,DNA提取率

2、低,而且差異裂解的效果受到檢驗人員的經(jīng)驗水平以及實際案件檢材的具體條件的影響,最終得到的STR分型圖譜常表現(xiàn)為混和斑,結果難于解釋,極大降低了混合斑檢驗鑒定結論的證據(jù)價值。
　　 針對上述問題,本研究擬利用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase-Ⅰ)消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或寡脫氧核苷酸的特性,將混合斑中女性DNA分解除去,再結合堿性裂解法消化精子,從而提取混合斑中精子DNA。
　　 首先從廣州血液中心購買20份精液檢

3、材,按梯度加生理鹽水稀釋；分別與20份口腔拭子混勻,制作成20份人工混合斑檢材。按照文獻方法應用 DNase-Ⅰ酶等裂解上述檢材中的口腔上皮細胞,建立DNase-Ⅰ純化結合堿性裂解法提取混合斑精子DNA的實驗流程。另將上述分離后的精子細胞應用堿性裂解法提取DNA,進行SIR分型檢測后統(tǒng)計分析比較。重復上述操作,直至應用最終調(diào)整的體系方法提取的混合斑精子 DNA,經(jīng)STR分型檢驗成功的樣本比例達到100％,并確定最終建立的分離上皮細胞和精

4、子細胞方法體系和精子DNA提取方法和體系。
　　 從公安系統(tǒng)DNA實驗室日常實際檢案中收集79份含精子細胞的陰道拭子(P30金標試紙條實驗呈陽性)。分別用DNase-Ⅰ純化結合堿性裂解法和差異裂解法提取混合斑中精子DNA,采用ldentifiler試劑盒進行15個STR基因座擴增,電泳檢測在3130xl遺傳分析儀上進行,應用Genemapper3.2軟件進行STR分型檢測。對于分型圖譜中正確分型的基因座達到15個、各等位基因峰高

5、于150RFU的樣本判定為檢驗成功的樣本。統(tǒng)計應用DNase-Ⅰ純化結合堿性裂解法和差異裂解法提取混合斑精子DNA經(jīng)STR分型檢驗成功的樣本數(shù)量、提取時間與費用,并做平行比較;應用SPSS13.0軟件對兩種提取方法的檢驗結果進行配對計數(shù)資料的 x2檢驗(McNemar)。對所建立的分離上皮細胞和精子細胞方法體系、精子DNA提取方法和體系準確性、重復性、提取效率等進行評估。應用DNase-Ⅰ純化結合堿性裂解法提取精子DNA,64例檢材分型

6、成功；應用差異裂解法提取精子DNA,57例檢材分型成功；兩種方法比較結果存在顯著性差異(P=0.039),Dnase-1純化結合堿性裂解法提取的精子 DNA的STR分型成功率更高,成本低廉。
　　 結論:DNase-Ⅰ純化結合堿性裂解法提取混合斑中精子 DNA與目前普遍采取的差異裂解法和其它改良方法相比,具有效果好、操作簡便、耗時少、成本低、易于實現(xiàn)自動化提取等優(yōu)點,可應用于處理刑事案件中各類混合斑精子DNA的提取,提高檢驗成功