Clostridium aceticum的代謝調(diào)控與利用CO2產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、生物乙醇是一種可再生的清潔能源，目前主要由植物原料生產(chǎn)，正逐漸成為汽油的替代燃料。Clostridium aceticum（C.aceticum）是一種嚴格厭氧的乙酸產(chǎn)生菌，它既能以H2+CO2為能源和碳源自養(yǎng)生長，又能以果糖、丙酮酸、延胡索酸為碳源異養(yǎng)生長。C.aceticum可通過Wood-Ljungdahl途徑將H2+CO2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并進一步代謝產(chǎn)生乙酸。乙醛鐵氧還原蛋白酶（Aldehyde Ferredoxin Oxid

2、oreductase，AOR）嚴格無氧條件下能將乙酸還原為乙醛，乙醛可進一步還原為乙醇。對AOR酶的研究表明，來自于菌株Pyrococcus furiosus和Thermococcus sp.ES-1的AOR酶具有乙酸還原活性。
　　本論文通過將AOR酶基因過表達，對野生型C.aceticum進行代謝改造，以重組質(zhì)粒的形式將乙酸還原酶AOR的編碼基因轉(zhuǎn)到野生型菌株，使重組型C.aceticum能利用CO2產(chǎn)生乙醇。本論文的研究結果

3、為構建利用CO2產(chǎn)生乙醇的工業(yè)微生物提供了新的途徑：
　?。?）C.aceticum AOR酶的生物信息學分析：先從C.aceticum的基因組中的查找到4個AOR酶編碼基因，進行多重序列比對后構建基于AOR酶氨基酸序列的分子進化樹，以進化關系為基礎選出編號為WP_44825795.1和WP_44824935.1的兩個AOR蛋白。對序列進行足跡定位分析，最終得到注釋為dhV、AFOR_N和AFOR_C的結構域，說明這兩個蛋白具有與

4、Thermococcus sp. EP1和P.furiosus AOR酶相似的功能。
　?。?）C.aceticum AOR酶的結構預測：蛋白的二級結構預測表明，編號為WP_044825795.1的AOR酶和P.furiosus AOR酶更具相似性，造成AOR酶蛋白結構差異的來源，主要為螺旋（H）其次為折疊結構（E）。通過同源建模預測三級結構，結果表明模板蛋白和目標蛋白的結構不同區(qū)主要集中在保守區(qū)域的端點處，保守區(qū)域內(nèi)部的結構高度

5、一致。
　?。?）AOR酶編碼基因上下游序列分析：可視化基因組序列，結果顯示AOR編碼基因閱讀框的方向與上下游基因相反，表明aor基因有一個單獨的啟動子。尋找并分析AOR酶編碼區(qū)上下游的序列，結果表明，在-10到-15位點的區(qū)間“AGGAGG”為AOR酶編碼基因的核糖體結合位點，在-17到-26位點的區(qū)間為“TATTTTTTAAA”Pribnow框。
　?。?）C.aceticum過表達AOR酶基因的代謝預測：重構C.ace

6、ticum全基因組酶蛋白的代謝反應途徑，結果顯示C.aceticum全基因組酶主要作用在生物代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信號處理、細胞過程、有機系統(tǒng)和致病系統(tǒng)。對C.aceticum重組菌的代謝預測表明，由于AOR酶的過表達，重組菌中的乙酸最終被還原成乙醇，且推測過表達菌株還有可能會產(chǎn)生L-乳酸，甲酸和三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物。
　?。?）AOR酶基因過表達C.aceticum的構建：根據(jù)前面的分析設計三對引物aor-prim，aor-

7、prim2和aor-prim3，以引物的最佳退火溫度進行PCR擴增，通過連接、轉(zhuǎn)化、篩選和驗證，得到三個重組質(zhì)粒pMTL82151_thl_aor，pMTL82151_thl_aor2和pMTL82151_thl_aor3。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli CA434，在通過結合將質(zhì)粒結合轉(zhuǎn)到C.aceticum中，經(jīng)篩選和驗證，得到過表達aor，aor2和aor2的重組型C.aceticum。
　?。?）野生型和重組型C.aceti