γδT細(xì)胞在急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型（水動(dòng)力法）中的變化分析.pdf

1、目的:γδT細(xì)胞是一類重要的非特異性免疫細(xì)胞。我們的前期研究表明，γδT細(xì)胞在慢性乙型肝炎患者中呈現(xiàn)表型及功能異常。而本課題將通過(guò)構(gòu)建急性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染小鼠模型，重點(diǎn)觀察肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的比例、激活表型及細(xì)胞因子表達(dá)的變化，探討γδT細(xì)胞在HBV急性感染清除機(jī)制中的作用。擬為全面揭示γδT細(xì)胞在HBV感染早期及慢性化過(guò)程中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.用尾靜脈

2、高壓水動(dòng)力法注射HBV基因組1.3倍體真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-HBV1.3)構(gòu)建急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型。
　　2.用免疫組化法檢測(cè)模型小鼠肝臟內(nèi)HBsAg及HBcAg的表達(dá);用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)模型小鼠外周血內(nèi)HBsAg及HBeAg水平。
　　3.用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)pcDNA3.1-HBV1.3質(zhì)粒模型組(pHBV組)、pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒組（pcDNA組）在質(zhì)粒注射后不同時(shí)間肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞

3、比例的變化。
　　4.用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)pHBV組肝臟中γδT細(xì)胞表面CD25與CD69激活分子表達(dá)的變化。
　　5.用流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)pHBV組肝臟中γδT細(xì)胞內(nèi)IFN-γ及TNF-α細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化。
　　6.用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析各時(shí)間點(diǎn)及各組間的差異。
　　結(jié)果:
　　1.急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型的構(gòu)建
　　1.1 pHBV組血清中的HBsAg在第1天即為陽(yáng)性（33.64±14.88

4、 COI），到第5天上升到最高（146.92±24.23 COI），而后逐漸降低。
　　1.2 pHBV組血清中的HBeAg在第1天為陽(yáng)性并達(dá)峰值(2.26±2.34COI)，然后降低。
　　1.3 pHBV組肝臟內(nèi)表達(dá)HBsAg或HBcAg肝細(xì)胞的陽(yáng)性率在第1天為最高(10～20％)，而后迅速降低(＜5％)。
　　1.4 pcDNA組的外周血及肝臟內(nèi)的HBV抗原在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為陰性。
　　2.急性HBV感染小鼠

5、模型肝臟、脾臟及外周血內(nèi)γδT細(xì)胞比例的變化
　　2.1正常對(duì)照小鼠(NC)肝臟中的γδT細(xì)胞比例（4.5±0.6％）明顯高于脾臟（2.1±0.3％）或外周血（1.2±0.6％），差異有顯著性(p＜0.01)。
　　2.2 pHBV組中，肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞的比例在第1天即升高至8.3±4.3％，而后降低，到第10天時(shí)，又升高至8.0±1.2％。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，pHBV1d的比例明顯高于NC，pHBV5d和pHBV15d的比例，

6、差異有顯著性(p＜0.05)。
　　2.3 pHBV組各時(shí)間點(diǎn)脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例與NC比較未見(jiàn)有明顯的變化，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　2.4 pcDNA組中，小鼠肝臟、脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例與NC比較差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　3.急性HBV感染小鼠模型肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞CD25及CD69表達(dá)的變化
　　3.1 NC肝臟中的CD25+γδT或CD69+γδT細(xì)胞比例分別為3.1

7、±0.5％、9.9±2.7％。
　　3.2 pHBV組小鼠肝臟內(nèi)CD25+γδT細(xì)胞比例在第5天升高至最高8.4±3.7％，但各時(shí)間點(diǎn)間，及與NC間的差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　3.3 pHBV組小鼠肝臟內(nèi)CD69+γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，第10天的CD69+γδT細(xì)胞比例與其它時(shí)間點(diǎn)及NC比較差異有顯著性(p＜0.05)。
　　4.急性HBV感染小鼠模型肝臟的γδT細(xì)胞內(nèi)IFN-γ或TNF-α細(xì)

8、胞因子表達(dá)的變化
　　4.1正常對(duì)照小鼠(NC)肝臟中的IFN-γ+γδT或TNF-α+γδT細(xì)胞比例分別為5.1±0.4％、4.7±0.6％。
　　4.2 pHBV組第1天肝臟IFN-γ+γδT細(xì)胞比例升高至8.6±3.2％，之后即刻降低，與其它時(shí)間點(diǎn)及NC比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　4.3pHBV組肝臟內(nèi)TNF-α陽(yáng)性的γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間而緩慢上升，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間或與NC間的差異無(wú)顯著性(p＞0.