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文檔簡介
1、目的:分子流行病學(xué)方法檢測肝癌患者中HBV病毒株MHBst的種類,并研究各種MHBst的反式激活能力及對細胞的增殖、成瘤和凋亡影響。以免疫沉淀的方法篩選MHBst167候選結(jié)合蛋白。探討截短中蛋白在肝細胞內(nèi)的可能存在的分子作用機制。
方法:應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和Alu-PCR技術(shù)自HBV感染肝癌患者外周血和肝癌組織中擴增S基因序列,并進行pMD18-T載體的TA克隆,隨機選擇部分克隆進行DNA測序并對測序結(jié)果進行生物
2、信息學(xué)分析。應(yīng)用GeneTailor Site-DirectedMutagenesis System突變S蛋白的起始密碼子,將S基因點突變成功的不同MHBst構(gòu)建真核表達載體和腺病毒表達載體,轉(zhuǎn)染或感染細胞后Western-blot驗證其蛋白的表達。通過啟動子激活螢火蟲螢光素酶的表達研究不同MHBst反式激活功能。通過CCK-8、軟瓊脂克隆形成及TUNEL方法觀察不同截短型的中蛋白對細胞增殖、成瘤及凋亡功能的影響。以免疫沉淀的方法篩選出
3、MHBst167結(jié)合蛋白。
結(jié)果:成功自80例HBV感染肝癌患者的血清中獲得700多個S基因的陽性克隆,通過測序獲得600條S區(qū)基因序列,發(fā)現(xiàn)7種分別在77,90,116,124,129,227,254處氨基酸終止編碼的MHBst;其中129,227,254三種MHBst出現(xiàn)的頻率較高,分別為15%(12/80),7.5%(6/80)和20%(16/80);12例MHBst129全為C基因型,6例MHBst227只有1例為
4、B基因型,其余為C基因型,而16例254只有1例為C基因型,其余均為B基因型。Alu-PCR從30例肝癌標(biāo)本中檢測出3例標(biāo)本有S基因的整合,共發(fā)現(xiàn)了9種整合位點。對8種不同MHBst和完整中蛋白成功進行了小蛋白起始密碼子的突變。構(gòu)建了8種不同MHBst和完整中蛋白的pCDNA3.1、p3xflag-cmv-10真核表達載體,并成功獲得MOI值分別為:Ad-77:160,Ad-90:320,Ad-116:320,Ad-124:320,Ad
5、-129:320,Ad-227:500,Ad-254:320,Ad-167:160,Ad-281:160,Ad-GFP:320的病毒液。獲得了能夠分別表達SV40、c-fos、c-myc啟動子的細胞株。不同MHBst的反式激活能力、增殖及克隆形成能力不同。MHBst167可以通過TRAIL誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞凋亡并可以被阻斷劑PD98059。免疫沉淀方法獲得了相互作用蛋白醛縮酶B。
結(jié)論:HBV感染肝癌患者血清中存在7種不同類型M
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