動(dòng)脈粥樣硬化的新調(diào)控基因——JAZF1和KLF14.pdf

1、第一部分 JAZF1影響膽固醇代謝的分子機(jī)制研究
　　目的:探討JAZF1過表達(dá)對(duì)小鼠體內(nèi)外膽固醇代謝的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　方法:用RT-qPCR檢測(cè)肝組織中JAZF1、HMGCR、LDLR、PPARa、SREBP2、INSIG2和SCAP等膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá);用Western Blot檢測(cè)JAZF1、HMGCR和p-CREB的蛋白表達(dá);采用原代細(xì)胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建JAZF1過表達(dá)細(xì)胞模型;雙熒光

2、素酶報(bào)告系統(tǒng)分析JAZF1調(diào)節(jié)HMGCR轉(zhuǎn)錄活性及結(jié)合位點(diǎn);化學(xué)比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇及相關(guān)脂質(zhì)指標(biāo)水平變化。
　　結(jié)果:Ad-JAZF1感染使C57BL/6J小鼠肝臟內(nèi)JAZF1 mRNA升高約51％，蛋白表達(dá)升高約60％。感染使高脂喂養(yǎng)的ApoE KO小鼠肝臟中JAZF1 mRNA水平升高37％、蛋白質(zhì)水平升高近60％; TAK1蛋白水平下降50％; HMGCR的mRNA水平下降80％左右，蛋白降低約50％。Ad-JAZF1轉(zhuǎn)

3、染使原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中JAZF1的mRNA水平升高近50倍、蛋白升高3倍左右、TC下降27％，HMGCR mRNA和蛋白水平分別下降51％和47％。pGL3-CRE與Ad-JAZF1同時(shí)處理使原代肝細(xì)胞中熒光素酶活性下降54％，而pGL3-muCRE與Ad-JAZF1同時(shí)處理時(shí)與對(duì)照組相比熒光素酶活性無差異。JAZF1過表達(dá)引起CREB在Ser133位點(diǎn)磷酸化水平下降26％。
　　結(jié)論:JAZF1過表達(dá)能抑制TAK1、HMGCR的表

4、達(dá)、降低血漿膽固醇、肝臟組織和原代肝細(xì)胞中總膽固醇水平;抑制CREB在Ser133位點(diǎn)磷酸化水平;經(jīng)CREB途徑抑制HMGCR活性和膽固醇的從頭合成作用。
　　第二部分 KLF14在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究
　　目的:通過改變KLF14在體內(nèi)外的表達(dá)，探討其對(duì)脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的影響，并研究其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:用基因重組技術(shù)構(gòu)建KLF14過表達(dá)質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-KLF14)、干擾質(zhì)粒

5、（pGenesil-shKLF14）和干擾腺病毒(pAd-shKLF14);用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建巨噬細(xì)胞KLF14過表達(dá)和抑制表達(dá)模型;Ac-LDL誘導(dǎo)形成小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞;MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;用3H-cholesterol標(biāo)記巨噬細(xì)胞，液體閃爍計(jì)數(shù)法(LSC)測(cè)定細(xì)胞膽固醇流出率;RT-qPCR測(cè)定KLF14、ABCA1、IL-6、TNFα、MCP-1的mRNA表達(dá)水平;Western Blots測(cè)定KLF14、ABCA1、p-

6、TAK1/t-TAK1、p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表達(dá)水平;用SB203580、PD098059、SP600125分別抑制p38、ERK1/2、JNK的蛋白磷酸化水平，并檢測(cè)KLF14表達(dá)改變對(duì)MAPK信號(hào)通路和炎癥因子表達(dá)的影響。24只雄性ApoE-/-小鼠，鼠齡7周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為高脂喂養(yǎng)+PBS組（HF-A組，n=8）、高脂+pAd-GFP組(GFP-A組，n=8)和高脂+pAd-s

7、hKLF14組（shK-A組，n=8），均喂養(yǎng)12周，于高脂喂養(yǎng)第8周末和第10周末分別給予尾靜脈注射PBS、pAd-GFP和pAd-shKLF14;油紅O染色觀察小鼠主動(dòng)脈竇及大體的粥樣斑塊形成情況;用酶法測(cè)定細(xì)胞及血漿中膽固醇濃度。
　　結(jié)果:KLF14在高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J、普食喂養(yǎng)apoE KO小鼠及高脂喂養(yǎng)apoE KO小鼠體內(nèi)mRNA和蛋白表達(dá)水平均比正常飲食小鼠升高;未添加Ac-LDL處理時(shí)，KLF14過表達(dá)使

8、RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TC水平升高約16％、CE升高25％、CE/TC升高7％，抑制表達(dá)降低TC約9％、CE約20％、CE/TC約13％;在添加Ac-LDL處理后，KLF14過表達(dá)使RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TC水平升高27％、CE升高36％、CE/TC升高7％;抑制表達(dá)降低TC約16％、CE約32％、CE/TC約19％。KLF14過表達(dá)增加了p38、ERK1/2的蛋白磷酸化水平，而JNK磷酸化水平無顯著性差異。KLF14過表達(dá)使小鼠巨噬細(xì)

9、胞內(nèi)炎癥因子IL-6、TNFα和MCP-1的mRNA表達(dá)與對(duì)照組分別增加了68％、120％和238％。用化學(xué)抑制劑抑制p-p38、p-ERK1/2后，在RAW264.7細(xì)胞中過表達(dá)KLF14不能使炎癥因子表達(dá)水平升高，而抑制p-JNK后KLF14過表達(dá)的作用不明顯;而抑制KLF14表達(dá)后上述作用呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。過表達(dá)KLF14能顯著降低ABCA1的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別達(dá)69％和65％，降低細(xì)胞膽固醇流出率達(dá)63％。在高脂喂養(yǎng)的apo

10、E KO小鼠體內(nèi)，pAd-shKLF14使肝臟中KLF14表達(dá)下降50％、主動(dòng)脈中中性脂質(zhì)的含量及主動(dòng)脈竇中粥樣斑塊的面積減少，并顯著降低血液中TC水平，LDL、TG有下降趨勢(shì)，而HDL有升高趨勢(shì)。
　　結(jié)論:KLF14在高脂喂養(yǎng)和動(dòng)脈粥樣硬化高風(fēng)險(xiǎn)的小鼠肝臟內(nèi)有高表達(dá);在小鼠巨噬細(xì)胞中過表達(dá)KLF14能誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化、增加胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯含量，經(jīng)p38、ERK1/2途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)和炎癥因子IL-6、TNFα和MCP-1的釋