淀粉樣多肽促進(jìn)病毒感染的分子機(jī)制及其拮抗艾滋病防治藥物抗HIV活性的研究.pdf

1、背景：艾滋病是以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病,自其被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生存,對(duì)全球人口健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。伴隨著多年來(lái)的研究,艾滋病在治療上取得了很大的進(jìn)展,譬如高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy,HAART,又稱(chēng)為“雞尾酒”療法)的應(yīng)用。但是,病毒耐藥一直是艾滋病治療的第一大問(wèn)題,有些患者甚至一開(kāi)始就對(duì)某些藥物耐藥。而艾滋病的預(yù)防,包括HIV

2、疫苗以及殺微生物劑(Microbicides)的研發(fā),更是進(jìn)展緩慢。一些人體內(nèi)存在的增強(qiáng)病毒感染的因素,如抗體依賴性的病毒增強(qiáng)作用,被認(rèn)為是導(dǎo)致艾滋病疫苗失敗的一大原因。近年來(lái)有研究表明精液本身能成數(shù)量級(jí)地促進(jìn)HIV感染,可能是多個(gè)殺微生物劑大規(guī)模臨床試驗(yàn)失敗的原因之一。此外,一些病毒自身的蛋白,比如HIV Nef,也能增強(qiáng)HIV的感染和傳播。正是由于對(duì)HIV的傳播和免疫清除機(jī)制不甚了解,導(dǎo)致至今仍然沒(méi)有成功的HIV疫苗和殺微生物劑可供

3、艾滋病的預(yù)防?，F(xiàn)有的抗艾滋病藥物也不能徹底根治這一疾病。
　　 在本課題組成員的前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)衍生于HIV-1 MN毒株包膜蛋白的病毒與輔助受體結(jié)合的位點(diǎn)的多肽6313和跨膜區(qū)的多肽6380能拮抗HIV融合抑制劑T-20的抗病毒活性,當(dāng)時(shí)推測(cè)由于T-20能特異與gp120輔助受體結(jié)合區(qū)和gp41跨膜區(qū)結(jié)合,因而具有多靶點(diǎn)的抗HIV融合的機(jī)制。然而,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)T-20不能與gp120輔助受體結(jié)合區(qū)或gp41跨膜區(qū)結(jié)合。相

4、反,這區(qū)段的多肽能顯著地促進(jìn)HIV的感染活性。正是由于這種增強(qiáng)病毒感染的效應(yīng),抵消了T-20的抑制活性。那么gp120其它區(qū)段的多肽也具有增強(qiáng)病毒感染的活性嗎?這些多肽增強(qiáng)病毒感染活性的機(jī)制是什么呢?多肽MN-6313能拮抗T-20的抗病毒活性,那么MN-6313也能拮抗其它臨床上使用的抗病毒藥物的抗病毒活性嗎?gp120是裸露在細(xì)胞表面,而且游離的gp120是存在于機(jī)體內(nèi)的,在體內(nèi)各種酶、催化抗體存在下,gp120能否水解出這些能增強(qiáng)

5、病毒感染的多肽,從而促進(jìn)AIDS疾病的病程嗎?對(duì)于這些問(wèn)題的闡明將有助于深入了解艾滋病的發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)程,并為艾滋病疫苗的開(kāi)發(fā)和艾滋病輔助治療藥物新靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù)。
　　 聯(lián)合國(guó)2009年全球艾滋病流行狀況報(bào)告顯示,異性間性傳播已成為艾滋病傳播的主要途徑,其比例高達(dá)80％,在非洲一些國(guó)家更高達(dá)90％。在中國(guó)性傳播已成為艾滋病的最主要傳播途徑。因此,陰道局部使用的殺微生物劑(microbicide),被認(rèn)為是預(yù)防HIV傳染的

6、有效手段。專(zhuān)家曾預(yù)測(cè),第一代殺微生物劑有望在2010年上市。然而,至今還沒(méi)有一個(gè)成功的殺微生物劑問(wèn)世。有6個(gè)候選的殺微生物劑已完成Ⅱ/Ⅲ期臨床,試驗(yàn)結(jié)果都令人失望。其中三個(gè)是陰離子多聚物。這類(lèi)化合物沒(méi)有預(yù)防HIV感染的療效,個(gè)別還增加HIV感染的機(jī)率。
　　 研究發(fā)現(xiàn),精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子(Semen-derived Enhancer of VirusInfection,SEVI)能形成淀粉樣纖維并增強(qiáng)病毒的感染。蛋白聚糖的糖

7、鏈在很多淀粉樣沉積疾病發(fā)揮著重要的作用。鑒于蛋白聚糖的糖鏈與陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑具有相似的結(jié)構(gòu),陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑能否與精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子相互作用并促進(jìn)精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子的形成,成為這類(lèi)候選殺微生物劑臨床失敗的分子機(jī)制呢?
　　 因此本課題擬進(jìn)行以下兩部分內(nèi)容的探討:(1)衍生于HIV-1gp120淀粉樣多肽促進(jìn)病毒感染機(jī)制的研究。對(duì)衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽進(jìn)行掃描,尋找具有增強(qiáng)病毒

8、感染的活性多肽,深入研究這些多肽促進(jìn)病毒感染的機(jī)制；分析淀粉樣多肽對(duì)于目前高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物抗病毒藥效的影響;初步探討HIV-1 gp120體外的降解。(2)精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子拮抗陰離子聚合物抗病毒分子機(jī)制的研究。擬采用生物物理、生物化學(xué)手段,深入研究陰離子多聚物與精液蛋白的相互作用,探討其對(duì)精液蛋白淀粉樣纖維形成的影響,分析精液蛋白降低陰離子多聚物抗HIV活性的分子機(jī)制。
　　 第一部分、來(lái)源于HIV-1 gp120

9、的淀粉樣多肽促進(jìn)病毒感染的研究
　　 目的:建立不同嗜性的HIV-1感染性克隆(X4、R5、X4R5受體嗜性的感染克隆)體系,利用衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽篩選具有增強(qiáng)病毒感染活性的多肽片段；深入研究這些多肽促進(jìn)病毒感染的機(jī)制,探討這些具有增強(qiáng)病毒感染活性的多肽對(duì)當(dāng)前高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)藥物抗病毒藥效的影響；初步研究HIV-1gp120體外的降解及分析降解產(chǎn)物；尋找有效的小分子藥物拮抗包膜

10、蛋白衍生的多肽促進(jìn)病毒感染的活性。
　　 方法:
　　 1.建立了CCR5,CXCR4,X4R5不同受體嗜性的克隆病毒系統(tǒng),將表達(dá)NL4-3(X4受體嗜性的)病毒全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒,81A(R5受體嗜性的)病毒全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒和嵌合了NL4-3和81A病毒(雙受體嗜性)全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,收集的病毒上清液用于多肽對(duì)病毒感染的促進(jìn)作用的研究。利用X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽篩選具有增強(qiáng)病毒感染

11、活性的多肽片段。利用不同的HIV-1臨床分離株,不同的細(xì)胞感染方式,包括自由病毒感染靶細(xì)胞,病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播來(lái)研究與確證篩選出來(lái)具有增強(qiáng)病毒感染活性的作用。通過(guò)PyMOL軟件分析,多肽序列對(duì)比,分析這些HIV-1 gp120來(lái)源的具有增強(qiáng)病毒感染多肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。XTT毒性實(shí)驗(yàn)研究多肽對(duì)于靶細(xì)胞的毒性作用。
　　 2.利用生物化學(xué)、物理化學(xué)、病毒學(xué)的方法對(duì)這些具有增強(qiáng)病毒感染多肽的機(jī)制進(jìn)行深入研究。首先利用硫磺素T染色法,

12、透射電子顯微鏡法確證這些具有增強(qiáng)病毒感染的多肽能形成淀粉樣纖維；利用Time-of-addition,eGFP標(biāo)記的假病毒體系結(jié)合細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究這些具有增強(qiáng)病毒感染的淀粉樣多肽是作用在病毒進(jìn)入的階段；設(shè)計(jì)Virus pull-down assay,cell-binding assay及陰離子多聚物拮抗結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究具有增強(qiáng)病毒感染的淀粉樣多肽是通過(guò)結(jié)合病毒和靶細(xì)胞,從而把兩者拉近來(lái)促進(jìn)病毒的感染。
　　 3.選用當(dāng)今臨床應(yīng)用的高

13、效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物,包括進(jìn)入抑制劑,非/核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等藥物,通過(guò)設(shè)立藥物對(duì)照組、藥物+多肽組,研究這些藥物在淀粉樣多肽存在下,抗病毒活性的變化。主要討論淀粉樣多肽對(duì)臨床抗HIV藥物抗實(shí)驗(yàn)株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影響。
　　 4.通過(guò)與硫磺素T結(jié)合實(shí)驗(yàn)、剛果紅結(jié)合實(shí)驗(yàn)、透射電鏡等方法分析小分子化合物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)于抑制淀粉樣多肽纖維的形成作用以及打斷

14、成熟的淀粉樣纖維的形態(tài)的作用。利用病毒感染實(shí)驗(yàn),觀察EGCG拮抗淀粉樣多肽促進(jìn)病毒感染的作用,分析EGCG是否能恢復(fù)由于淀粉樣多肽存在抗病毒藥物降低的抗病毒活性。
　　 5.建立Western blot方法,追蹤分析體外HIV-1 gp120降解的成分,通過(guò)透射電鏡的觀察,探討HIV-1 gp120降解產(chǎn)物形成淀粉樣纖維的可能。
　　 結(jié)果:
　　 1.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,在低濃度病毒感染下,利用克隆病毒體系,建立了研

15、究多肽促進(jìn)病毒感染的病毒系統(tǒng)。
　　 2.從120多條衍生于HIV-1gp120的含15個(gè)氨基酸的多肽中,篩選出近1/3的多肽具有增強(qiáng)病毒感染的活性,這些多肽普遍對(duì)HIV-1不同受體嗜性的克隆病毒、臨床分離的病毒毒株(包括A、B、C、D亞型的毒株),都有增強(qiáng)病毒感染的活性,也具有促進(jìn)病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播作用。
　　 3.通過(guò)PyMOL軟件分析,多肽序列對(duì)比,我們發(fā)現(xiàn)這些具有增強(qiáng)病毒感染活性的多肽來(lái)源于HIV-1gp1

16、20的β-折疊結(jié)構(gòu)域,與來(lái)源于α-螺旋區(qū)域的多肽比較,增強(qiáng)病毒感染的活性有顯著差異(P＜0.05)。這提示來(lái)源于β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽更容易促進(jìn)病毒感染。由于這些增強(qiáng)病毒感染的多肽溶液大多是渾濁的,經(jīng)硫磺素T染色法和透射電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)這些促進(jìn)病毒感染的多肽都能形成淀粉樣纖維。淀粉樣纖維是一種富含β-片層結(jié)構(gòu)的大分子聚合物。
　　 4.這些HIV-1gp120來(lái)源的淀粉樣多肽能促進(jìn)病毒感染的活性是作用在病毒進(jìn)入階段。Time-o

17、f-addition實(shí)驗(yàn)表明,病毒在結(jié)合細(xì)胞后加入多肽,與病毒在結(jié)合細(xì)胞前加入多肽相比較,多肽對(duì)病毒增強(qiáng)作用有顯著性差異(P=0.000)。利用eGFP標(biāo)記的HIV-1 NL4-3假病毒系統(tǒng)表明,在4℃溫度下(病毒并不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)),用流式細(xì)胞儀檢測(cè),淀粉樣多肽能促進(jìn)病毒結(jié)合到細(xì)胞表面。Viruspull-down assay,cell-binding assay表明,這些淀粉樣多肽能分別捕獲病毒或結(jié)合到細(xì)胞表面,從而增強(qiáng)病毒的感染性。但

18、陰離子聚合物未能拮抗gp120衍生的淀粉樣多肽對(duì)病毒與細(xì)胞的結(jié)合,這說(shuō)明gp120衍生的淀粉樣多肽不是依靠靜電吸附力與病毒或細(xì)胞結(jié)合的。
　　 5.來(lái)源于gp120β20的淀粉樣多肽6313能降低高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物的抗病毒活性,2μM的6313能使抗病毒藥物的抗病毒活性降低3-16倍。
　　 6.EGCG能有效的抑制gp120來(lái)源的淀粉樣多肽的形成,阻斷淀粉樣纖維的形態(tài),拮抗淀粉樣多肽介導(dǎo)的增強(qiáng)病毒感染的活性,使抗

19、病毒藥物,在淀粉樣多肽存在降低的抗病毒活性恢復(fù)正常水平。
　　 7.體外gp120多肽的降解實(shí)驗(yàn)表明,在37℃孵育下,gp120能緩慢釋放一些小分子量短肽片段(～4K),而且通過(guò)透射電鏡能觀察出淀粉樣纖維狀物質(zhì)。
　　 結(jié)論:
　　 1.低濃度病毒量適用于多肽/化合物增強(qiáng)病毒感染活性的檢測(cè)。
　　 2.HIV-1gp120衍生的具有增強(qiáng)病毒感染活性的多肽來(lái)源于gp120β-折疊區(qū)域,其促進(jìn)病毒感染的機(jī)制是

20、形成富含β-片層結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維狀的聚合物,這些大分子聚合物能結(jié)合病毒與靶細(xì)胞,從而把兩者拉近,促進(jìn)病毒的感染。gp120衍生淀粉樣多肽能廣譜促進(jìn)不同亞型,不同受體嗜性病毒的感染,而且也能促進(jìn)病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播。
　　 3.這些來(lái)源于gp120β-折疊區(qū)域的多肽,有可能原因具有結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì),易于聚集形成β-片層結(jié)構(gòu)而形成淀粉樣纖維的形態(tài),進(jìn)而促進(jìn)病毒的感染。對(duì)于多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)與淀粉樣形成趨勢(shì)相關(guān)性的研究與分析,對(duì)于我們科研工作

21、中隨機(jī)設(shè)計(jì)合成淀粉樣多肽用于一些基因治療藥物或技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新思路。
　　 4.體外HIV-1gp120降解實(shí)驗(yàn)初步證明,在37℃孵育條件下,gp120不穩(wěn)定,能釋放出一些小分子量的多肽,并檢測(cè)出淀粉樣纖維的存在。這些淀粉樣多肽不僅能促進(jìn)病毒的感染,而且能拮抗抗病毒藥物的抗病毒活性,也即說(shuō)明,這些淀粉樣物質(zhì)的存在,能降低病人對(duì)藥物的敏感性。雖然現(xiàn)在普遍認(rèn)為病人的耐藥性與病毒的基因突變相關(guān),但有文獻(xiàn)報(bào)道[58],在產(chǎn)生耐藥的人群中

22、,有接近20％的病例可能與病毒基因型耐藥無(wú)關(guān)。HIV-1gp120是存在于人體內(nèi)的。那么,在人體內(nèi)HIV-1 gp120是否能降解釋放出這些淀粉樣多肽,從而一方面促進(jìn)病毒感染,影響疾病的進(jìn)程?另一方面使病人對(duì)藥物的敏感性降低呢?本課題的研究為回答以上兩個(gè)gp120降解生理意義的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 5.EGCG是一個(gè)有效的抑制和阻斷淀粉樣物質(zhì)的小分子藥物。EGCG能有效的抑制gp120來(lái)源的多肽形成淀粉樣結(jié)構(gòu),阻斷淀粉樣纖維的形

23、態(tài),拮抗淀粉樣多肽增強(qiáng)病毒感染的活性,使抗病毒藥物在淀粉樣多肽存在降低的抗病毒活性得到恢復(fù)。
　　 第二部分、精液蛋白拮抗陰離子型多聚物類(lèi)殺微生物劑抗HIV活性的分子機(jī)制研究
　　 目的:本研究擬采用多種生物物理、生物化學(xué)手段,深入研究陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑與精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子(SEVI)的相互作用及機(jī)制,從而從藥物-宿主蛋白相互作用的角度,闡明一個(gè)陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑臨床試驗(yàn)失敗的原因。研究?jī)?nèi)容包括陰離子多聚

24、物殺微生物劑促進(jìn)精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子的淀粉樣纖維的形成,陰離子多聚物與精液相關(guān)蛋白的相互作用,以及相關(guān)的藥物抗病毒活性的評(píng)價(jià)。研究結(jié)果將提示精液蛋白對(duì)于評(píng)價(jià)殺微生物劑的重要性,也將指出哪類(lèi)藥物不適合開(kāi)發(fā)為殺微生物劑,對(duì)于未來(lái)殺微生物劑的研發(fā)具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 方法:
　　 1.我們選取以下陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑作為我們研究的對(duì)象,包括:硫酸纖維素(Cellulose sulfate,CS),角叉菜膠(Ca

25、rrageenan),鄰苯二甲酸纖維素(Cellulose acetate1,2-benzenedicarboxylate,CAP),聚苯乙烯磺酸鈉(Polystyrene sulfonate)。建立起一系列生物物理、生物化學(xué)手段,包括硫磺素T染色法,剛果紅染色法,圓二色譜法,透射電鏡法,探討陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑促進(jìn)精液來(lái)源的病毒增強(qiáng)因子,即SEVI,淀粉樣纖維形成的作用。并考察這種促進(jìn)作用的量效關(guān)系。
　　 2.建立酸性凝

26、膠電泳法、Western blot及ELISA分析陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑與精液來(lái)源多肽(即SEVI原型多肽PAP248-286)的相互作用。
　　 3.分別考察在PAP248-286或精液存在下,陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑抗實(shí)驗(yàn)株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影響。
　　 4.考察在陰離子多聚物類(lèi)殺微生物劑存在下,PAP248-286或精液促進(jìn)克隆病毒NL4-3(X4型病毒)和81A(R5型病毒)

27、感染活性的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過(guò)硫磺素T染色法,剛果紅染色法,圓二色譜法,透射電鏡法,本研究所包括的陰離子多聚物殺微生物劑都能普遍加速PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維的過(guò)程,并且這種促進(jìn)作用呈量效關(guān)系。陰離子多聚物殺微生物劑促進(jìn)PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維是通過(guò)促進(jìn)其β-片層結(jié)構(gòu)的形成。
　　 2.通過(guò)酸性凝膠電泳法、Western blot及ELISA,我們證明了陰離子多聚物殺微生

28、物劑與多肽PAP248-286能夠相互作用,通過(guò)采用其它天然陰離子多聚物拮抗聚合的實(shí)驗(yàn),證明這種結(jié)合是通過(guò)靜電吸引力相互作用的。
　　 3.在PAP248-286或精液存在下,各陰離子多聚物殺微生物劑抗實(shí)驗(yàn)株病毒ⅢB或BaL病毒的感染活性下降了8～20倍。
　　 4.在各陰離子多聚物殺微生物劑存在下,PAP248-286形成的淀粉樣纖維與精液的沉淀部分都能促進(jìn)病毒的感染。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究表

29、明,陰離子多聚物殺微生物劑與精液蛋白能相互作用。這種相互作用體現(xiàn)的藥物抗病毒活性的下降可總結(jié)為以下兩個(gè)原因。其一,藥物與宿主蛋白相互作用,降低了游離藥物的濃度,使得藥物抗病毒效果下降；其二,陰離子多聚物殺微生物劑與精液來(lái)源病毒增強(qiáng)因子的相關(guān)多肽相互作用,加速這些多肽的聚合并形成淀粉樣纖維,從而增加了精液中增強(qiáng)病毒感染的因素,進(jìn)一步削弱了體系中的抗病毒活性。
　　 2.本研究提示:精液作為殺微生物劑研究的重要媒介,應(yīng)給予足夠的重視