重樓不同部位藥用成分分析及SQS基因的原核表達(dá)分析.pdf

1、重樓是一味有止血、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用的傳統(tǒng)中藥。主要活性成分為甾體皂苷，根莖為主要藥用部位，地上部分多被遺棄。根莖需3-5年才能入藥，資源再生較慢，野生資源緊缺。重樓屬在我國(guó)約有17種10變種，在選取優(yōu)質(zhì)品種推廣種植的同時(shí)，開(kāi)發(fā)新的重樓資源是緩解重樓藥用資源緊缺的重要途徑。本文利用HPLC法對(duì)4種重樓根、莖、葉、果實(shí)的多種甾體皂苷及皂苷元含量進(jìn)行了定量的檢測(cè)，通過(guò)對(duì)重樓根部與地上部分中藥用成分含量的相關(guān)性分析，建立篩選重樓優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的

2、新方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)重樓種植廢棄物莖、葉、果實(shí)的藥用價(jià)值評(píng)估，開(kāi)發(fā)新的藥用資源。另外，隨著近年來(lái)重樓在組培上技術(shù)上突破，利用生物工程技術(shù)對(duì)重樓資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)具有了可行性。異戊二烯途徑為甾體皂苷的生物合成途徑，但其途徑中關(guān)鍵酶的研究較少。本文從華重樓中克隆了關(guān)鍵酶鯊烯合酶（PpSQS）基因的cDNA序列，并進(jìn)行了序列分析和原核表達(dá)，為利用次生代謝工程的方法，提高重樓品質(zhì)，開(kāi)發(fā)新的重樓資源提供前期研究基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下：
　　1）建

3、立了有效的甾體皂苷及皂苷元的提取和HPLC檢測(cè)方法。以薯蕷皂苷元，薯蕷皂苷，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)重樓的藥用價(jià)值，4種重樓中藥用價(jià)值最高的為七葉一枝花，其次為華重樓和球藥隔重樓，最低的為狹葉重樓。總體來(lái)看重樓根中的甾體皂苷及皂苷元的含量較其他部位的高，但七葉一枝花果皮中的薯蕷皂苷元、重樓皂苷Ⅰ，華重樓葉片中的薯蕷皂苷及皂苷元，以及球藥隔重樓葉片中的重樓皂苷Ⅰ的含量均較高，這些地上部分可作為新的藥用資源開(kāi)發(fā)的首選。四種

4、重樓均含有重樓皂苷Ⅰ，且在根中的含量與在莖、外種皮、果皮中的含量具有一定的相關(guān)性，這為利用地上部分藥用成分含量評(píng)估地下根中藥用價(jià)值提供可能。
　　2）以新鮮組培苗華重樓葉片為材料，提取總RNA。根據(jù)已報(bào)道的滇重樓SQS基因（Genbank號(hào)：KC442294.1）設(shè)計(jì)特異性引物。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出華重樓SQS基因，華重樓SQS的cDNA全長(zhǎng)為1296 bp，含有1227 bp的ORF。經(jīng)Blast比對(duì)，與滇重樓的相似度達(dá)到98％

5、。驗(yàn)證了相同物種同一基因編碼序列具有很高同源性。
　　3）通過(guò)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)反映出華重樓SQS具有較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基占64.55%，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基占到34.95%，幾乎無(wú)β-折疊。與已測(cè)定結(jié)構(gòu)的人類(lèi)鳘烯合酶類(lèi)似，通過(guò)構(gòu)建三級(jí)模型發(fā)現(xiàn)華重樓鳘烯合酶與人類(lèi)鳘烯合酶具有相似的活性中心，預(yù)示著華重樓可能與人的SQS基因具有相同的催化功能。并通過(guò)構(gòu)建SQS基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌E.coli-BL21中表達(dá)，