基于轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)基因水稻安全評(píng)價(jià)研究.pdf

1、近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，作物抗蟲、抗病、抗逆等問題相繼得到有效控制。然而，轉(zhuǎn)基因生物(GMO，Genetically Modified Organisms)在轉(zhuǎn)入外源基因獲得目標(biāo)性狀的同時(shí)，也可能會(huì)引起其他非預(yù)期效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性備受社會(huì)各界關(guān)注。目前為止，轉(zhuǎn)基因生物非預(yù)期效應(yīng)的研究大多數(shù)還停留在表型上的觀察，很少涉及到分子水平上的解析，因此，開展轉(zhuǎn)基因生物在分子水平上的非預(yù)期效應(yīng)研究很有必要。
　　本課題為了從轉(zhuǎn)

2、錄組水平對(duì)外源基因Cry1Ac、EPSPS在植物體內(nèi)表達(dá)而引起的非預(yù)期效應(yīng)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)展開了一系列工作。我們選取非轉(zhuǎn)基因水稻秀水11，以秀水11為受體轉(zhuǎn)入耐草甘膦基因(EPSPS)的水稻家系P1417、P1418，轉(zhuǎn)入抗蟲耐草甘膦基因(Cry1Ac，EPSPS)的水稻家系P1411、P1415為實(shí)驗(yàn)材料，在水稻的生長過程中對(duì)相關(guān)農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查、鑒定和統(tǒng)計(jì)，分析表型差異。同時(shí)利用TAIL-PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR確定轉(zhuǎn)基因水稻中外源

3、基因的插入位點(diǎn)及拷貝數(shù);提取轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因水稻樣本RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并將得到的結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析。
　　DNA分子驗(yàn)證、蛋白試紙條以及體外噴施草甘膦實(shí)驗(yàn)確定了P1411、P1415、P1417、P14184個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻家系中均有外源基因的插入，其中P1417、P1418均轉(zhuǎn)入了耐草甘膦基因EPSPS，P1411、P1415均轉(zhuǎn)入了抗蟲和耐草甘膦基因(Cry1Ac，EPSPS)。利用TAIL-PCR技術(shù)分別獲得了4個(gè)轉(zhuǎn)基因水

4、稻家系外源基因插入的側(cè)翼序列，然后通過NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)獲得的側(cè)翼序列進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)確定P1411、P1415、P1417、P14184個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻家系外源基因插入位置分別是:chromosome3/OSJNBb0016P23、chromosome3/OSJNBa0004G17、chromosome12/OJ1388_B05/Os12g0616500、chromos

5、ome11/OSJNBa0058G18，并且利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)確定了4個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻的插入拷貝數(shù)均為1個(gè)拷貝。
　　轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，P1411、P1415共有的差異表達(dá)基因有14個(gè)，沒有共有的GO顯著富集通路和KEGG顯著富集通路;P1417、P1418共有的差異表達(dá)基因有20個(gè)，沒有GO顯著富集通路及KEGG顯著富集通路。4個(gè)轉(zhuǎn)基因家系共有的差異基因有3個(gè)，分別為EPSPS、EPlOSAG00000010309、OS07G

6、0504200。其中EPlOSAG00000010309為非編碼RNA且沒有GO富集通路及KEGG富集通路;OS07G0504200為編碼蛋白，有1個(gè)KEGG富集通路;EPSPS為外源目的基因，有43個(gè)GO富集通路，4個(gè)KEGG富集通路。差異表達(dá)基因的富集通路均不顯著。4個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻家系鄰近基因的分析顯示，鄰近差異表達(dá)基因共有25個(gè)，且差異較小。對(duì)2個(gè)預(yù)期表達(dá)目的基因及2個(gè)非預(yù)期表達(dá)基因進(jìn)行相對(duì)定量驗(yàn)證，結(jié)果顯示這4個(gè)基因的表達(dá)均較穩(wěn)定

7、。
　　田間農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示抗蟲耐草甘膦水稻P1411、P1415的抽穗期晚于非轉(zhuǎn)基因及耐草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，這可能是P1411、P1415轉(zhuǎn)化體引起的特異性事件。而株高、分蘗數(shù)、百粒重等統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示相同轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因水稻沒有表現(xiàn)出一致的差異。
　　綜合轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果和田間農(nóng)藝性狀的考察，P1411、P1415、P1417、P14184個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻家系轉(zhuǎn)入外源基因Cry1Ac和EPSPS后會(huì)引起非預(yù)期效應(yīng)，但相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體