早實(shí)識(shí)模式轉(zhuǎn)化體系建立及基因工程創(chuàng)造柑橘無(wú)核新種質(zhì).pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文早實(shí)識(shí)模式轉(zhuǎn)化體系建立及基因工程創(chuàng)造柑橘無(wú)核新種質(zhì)姓名：譚彬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：果樹(shù)學(xué)指導(dǎo)教師：郭文武200904華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文個(gè)，再生芽經(jīng)G U S 染色、P C R 分析鑒定為陽(yáng)性，S o u t h e r nb l o t 結(jié)果表明所檢測(cè)的3個(gè)轉(zhuǎn)化株系中M A C l 2 ．2 基因以單拷貝插入。4 ．默科特橘橙成年態(tài)材料的滅菌及再生體系優(yōu)化。不同消毒方法和不同消毒劑濃度對(duì)成年態(tài)材料的滅菌效

2、果不同，其中以2 ．5 ％的次氯酸鈉二次消毒法處理默科特橘橙成年態(tài)莖段綜合效果最好；不同培養(yǎng)基對(duì)成年態(tài)莖段再生影響分析表明，不同配方對(duì)不定芽和不定根誘導(dǎo)能力不同，其中不定芽再生最佳配方為M T + 2 ．0m g ／LB A + 0 ．1m g ／L N A A ，不定根再生最佳配方為1 ／2M T d - O ．1 m g ／L B A + O ．5 g ／LA C d -0 ．2 5m g ／L N A A 。5 ．默科特橘橙上胚軸

3、切段再生及遺傳轉(zhuǎn)化。1 ) 激素B A 對(duì)默科特橘橙上胚軸切段不定芽的誘導(dǎo)起決定作用，而一定濃度的I A A 對(duì)不定芽的誘導(dǎo)起協(xié)同作用；當(dāng)B A 濃度為1 ．0m g ／L 、I A A 濃度為0 ．2m g ／L 時(shí)，外植體再生的不定芽總數(shù)和‘壯芽數(shù)’均達(dá)到最多；同時(shí)不定芽再生不定根的最佳配方為1 ／2M T 4 - 0 ．1m g ／L I B A + 0 ．5g ／LA C + 0 ．5m g ／LN A A 。2 ) 利用已建立

4、的默科特橘橙上胚軸切段的再生體系進(jìn)行C G l ．4 0 0 - R N a s e 基因的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為0 ．9 3 ％，獲得5 株轉(zhuǎn)化C G l —4 0 0 - R N a s e 基因的P C R 陽(yáng)性植株；轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾葲](méi)有明顯差異；其中3 株經(jīng)S o u t h e r n b l o t 分析表明，外源基因以雙拷貝形式插入。6 ．其它有核品種的上胚軸切段轉(zhuǎn)化C G I ．4 0 0 - R N a

5、s e 基因。1 ) 錦橙上胚軸切段的轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化率為3 ．9 4 ％，獲得l l 株轉(zhuǎn)化C G l ．4 0 0 - R N a s e 基因的初次P C R 檢測(cè)陽(yáng)性植株；1 1 株轉(zhuǎn)化植株經(jīng)多次P C R 分析，表明有8 株擴(kuò)增出目標(biāo)條帶；經(jīng)S o u t h e r nb l o t 分析，外源基因以單拷貝形式插入，而多次P C R 檢測(cè)呈陰性的轉(zhuǎn)基因株系J 3和J 9 沒(méi)有雜交信號(hào)，表明S o u t h e r n b l o

6、 t 是鑒定外源基因整合到植物基因組的最有效和最可靠的方法。2 ) 紅江橙和桃葉橙上胚軸切段的轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化率分別為1 ．3 8 ％和0 ．3 2 ％，分別獲得3 株紅江橙和1 株桃葉橙P C R 檢測(cè)陽(yáng)性植株，表明相同柑橘種類中的不同基因型，其轉(zhuǎn)化率也各不相同。本文還對(duì)擬南芥M A C l 2 ．2 基因在早實(shí)枳花器官和果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能，短童期種質(zhì)早實(shí)枳在柑橘基因功能驗(yàn)證和基因組學(xué)研究中的應(yīng)用前景，提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化率的方法