飼料高銅對豬腸道大腸桿菌抗生素耐藥協(xié)同作用的研究.pdf

1、畜牧業(yè)中，抗生素或用于預(yù)防和治療動物疾病，或添加到飼料中促進動物生長，為現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻，但是這也導(dǎo)致了動物腸道細菌嚴重的耐藥問題。銅不僅是動物細胞和細菌正常生長所必需，高水平銅也能抑制細菌生長，因此養(yǎng)豬生產(chǎn)中常在仔豬飼料中添加高銅以抗腹瀉、促生長，但是高銅也會誘導(dǎo)細菌的銅抗性。研究發(fā)現(xiàn)細菌的重金屬抗性和抗生素耐藥性之間存在多種形式的聯(lián)系，但是飼料高銅對于腸道大腸桿菌抗生素耐藥的形成是否存在協(xié)同作用？如果存在，其可能的機

2、制是什么？這些問題迄今尚未明了，本論文擬圍繞上述兩個關(guān)鍵科學(xué)問題開展深入系統(tǒng)研究，試驗分為四個部分:
　　一、斷奶前后仔豬和母豬糞便源大腸桿菌耐藥性和銅抗性的分析
　　本試驗旨在比較斷奶前后仔豬和母豬大腸桿菌耐藥性和銅抗性的變化，并分析其可能原因，為尋求控制大腸桿菌耐藥性形成與傳播的營養(yǎng)措施提供依據(jù)。試驗中，采用美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法，對分離自仔豬及其哺乳母豬的224株大腸桿菌的7種抗生素耐藥

3、性及銅抗性進行檢測。結(jié)果表明，224株大腸桿菌對7種抗生素均有不同程度的耐藥（耐藥率范圍28.13％～93.30％），70.09％的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性(MDR)。分離自母豬與哺乳仔豬的大腸桿菌抗生素耐藥率相似度較高，僅有對氨芐西林和慶大霉素的耐藥率差異顯著。而斷奶后仔豬源大腸桿菌的耐藥率相對于母豬和哺乳仔豬變化明顯，耐受頭孢噻呋、氟苯尼考和氯霉素的菌株都極顯著增加(P＜0.01)，耐受氨芐西林的菌株則顯著增加(P＜0.05)。相對于母

4、豬和哺乳仔豬，分離自斷奶后仔豬的大腸桿菌對銅的抗性程度明顯增加（P＜0.01）。大腸桿菌對銅抗性增加時，對抗生素耐藥性也有所變化，兩者之間有一定的相關(guān)性。母豬腸道內(nèi)的耐藥菌及飼料中的抗生素添加劑對仔豬大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生、維持與加劇發(fā)揮了重要作用，仔豬飼料中添加的高水平銅與大腸桿菌耐藥水平的變化存在一定的關(guān)系。
　　二、飼料高銅對斷奶仔豬大腸桿菌恩諾沙星耐藥協(xié)同作用的研究
　　本試驗旨在研究飼料高銅和恩諾沙星對腸道中大腸桿菌耐

5、藥性和銅抗性水平的影響，并探討飼料高銅在腸道大腸桿菌耐藥性形成中的協(xié)同作用。試驗以腸道細菌抗生素耐藥水平較低的10頭巴馬香豬為對象，分為低銅組（4 mg/kg）和高銅組(125mg/kg)，每組5頭仔豬。試驗開始后的第15天分別在兩組日糧中加入亞治療劑量的恩諾沙星，連續(xù)加藥10天。第25天，停止加藥，繼續(xù)分別飼喂低銅、高銅無抗日糧。于試驗的0、14、19、24、34、48天收集仔豬新鮮糞便樣品，分離并鑒定大腸桿菌。采用CLSI推薦的瓊脂

6、稀釋法，對分離株進行抗生素及銅敏感性的檢測。結(jié)果顯示:試驗過程中，因受飼料中銅和恩諾沙星的影響，兩組大腸桿菌分離數(shù)都不斷下降(P＜0.01)。低、高銅組隨飼料中恩諾沙星的添加和撤除，菌株耐藥性水平都先極顯著上升(P＜0.01)而后極顯著下降(P＜0.01)。高銅組菌株還表現(xiàn)為添加抗生素前恩諾沙星耐藥率極顯著高于同時期的低銅組(49.44％&4.05％，P＜0.01);撤除抗生素后大腸桿菌耐藥率仍顯著高于同時期的低銅組(14.86％&2.

7、70％，P＜0.05)。高銅組因高水平銅在飼料中持續(xù)添加，菌株銅抗性顯著高于低銅組(P＜0.05)，而低銅組菌株隨低銅日糧的持續(xù)飼喂銅抗性極顯著下降(P＜0.01)。大腸桿菌恩諾沙星耐藥性和銅抗性的變化上存在相關(guān)性，飼料添加恩諾沙星后，高銅組菌株銅抗性和耐藥性變化正相關(guān)（P＜0.01）;低銅組在給藥的中、后期，菌株銅抗性和耐藥性由負相關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)檎嚓P(guān)(P＜0.01)。因此，飼料中添加高銅和恩諾沙星對大腸桿菌耐藥性和銅抗性形成影響明顯，高銅

8、飼料對大腸桿菌耐藥性增加具有促進和維持作用。飼料高銅和恩諾沙星對大腸桿菌耐藥性形成可能具有協(xié)同作用。
　　三、斷奶香豬大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因、耐銅基因檢測及差異性分析
　　本試驗旨在研究斷奶香豬大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因、耐銅基因的攜帶情況，探討抗性基因與抗性表型的相關(guān)性、抗性基因間的相關(guān)性。本研究依據(jù)上一章的菌株MIC結(jié)果選取四種不同抗性表型菌株進行質(zhì)粒的提取，分別為高耐藥高耐銅菌株（恩諾沙星MIC＞32μ

9、g/mL，銅MIC≥24 mM）;高耐藥低耐銅菌株（恩諾沙星MIC＞32μg/mL，銅MIC＜24 mM）;高敏感高耐銅菌株（恩諾沙星MIC≤0.125μg/mL，銅MIC≥24 mM）;高敏感低耐銅菌株（恩諾沙星≤0.125μg/mL，銅MIC＜24 mM），共125株。PCR檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的4種喹諾酮類耐藥基因(qnrS、qepA、oqxAB、aac(6')-lb-cr）和兩種耐銅基因(pcoA、pcoD)。結(jié)果表明，125株大腸桿菌

10、中除qepA基因外，其余抗性基因檢出率均較高，oqxAB達到95.2％,其次是qnrS(92.0％)，aac(6')-lb-cr檢出率為81.6％; pcoA和pcoD的檢出率分別為48.8％、66.4％。111株菌株攜帶3種或3種以上的抗性基因。通過表型和基因型相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)抗性表型與抗性基因的檢出率有一定的相關(guān)性，表型耐藥菌株抗性基因檢出率較高。飼料中亞治療劑量恩諾沙星的添加導(dǎo)致aac(6')-lb-cr基因的檢出率增加(P＜0.

11、01)。多數(shù)抗性基因的檢出率具有相關(guān)性，如oqxAB和qepA、aac(6')-lb-cr與qepA都呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01);qepA和qnrS呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)。除qepA外，其他幾種喹諾酮類耐藥基因和抗銅基因間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。綜上所述，大腸桿菌普遍攜帶多種質(zhì)粒介導(dǎo)抗性基因，菌株耐藥表型與耐藥基因攜帶情況并不完全一致。耐藥基因和抗銅基因間具有相關(guān)性，從基因水平上可以初步推測大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)耐銅基因和喹

12、諾酮類耐藥基因間有同時水平傳播的可能性。
　　四、恩諾沙星和銅對體外模型中大腸桿菌恩諾沙星敏感性的影響研究
　　本試驗旨在體外研究銅對大腸桿菌恩諾沙星敏感性的影響和可能的機制。試驗選取分離自斷奶香豬糞便的兩株(M1，M2)敏感型大腸桿菌(恩諾沙星MIC=0.5μg/mL，銅MIC=20 mM)，分別于添加恩諾沙星(0.25μg/mL)、硫酸銅(10 mM)、硫酸銅(10 mM)和恩諾沙星(0.25μg/mL)的MH肉湯（恩諾

13、沙星組、銅組、恩諾沙星加銅組）中培養(yǎng)并傳代，采用瓊脂稀釋法測定第3、6、9、12、15、18代菌株的恩諾沙星和銅MIC值，PCR檢測第0和18代菌株質(zhì)粒介導(dǎo)抗性基因的攜帶情況。結(jié)果表明:經(jīng)誘導(dǎo)后，兩株菌株恩諾沙星和銅MIC值都有所變化。兩株菌的恩諾沙星MIC值，在恩諾沙星組中都顯著提高8倍，產(chǎn)生耐藥性;恩諾沙星加銅組中，兩株菌株的恩諾沙星MIC值提高了4倍，處于耐藥中介范圍。兩株菌株的銅MIC值，在恩諾沙星組均有所上升，M2達28 mM