豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對仔豬消化道局部和全身免疫水平的影響.pdf

1、豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種高度接觸性傳染病，主要通過消化道進行傳播，能引起2周齡以下仔豬嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率。通過消化道口服免疫可直接切斷豬傳染性胃腸炎病毒的感染和傳播途徑，有效控制豬傳染性胃腸炎的發(fā)生。然而滅活全病毒單獨口服免疫不足以有效激發(fā)機體的免疫應答，需選擇合適的黏膜佐劑來增強疫苗的免疫原性，進而達到良好的免疫效果。近年來利用CpG作為黏膜免疫增強劑已成為疫苗領域的研究熱點。CpG作為有效的黏膜佐劑

2、在小鼠上已有大量研究，但在豬上其相關報道較少。因此本試驗通過體外和體內(nèi)試驗研究探討CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對仔豬消化道局部和全身免疫水平的影響，為研究應激性小、保護力高的豬傳染性胃腸炎口服疫苗奠定基礎。首先，通過體外試驗檢測CpG對豬脾臟淋巴細胞的免疫刺激作用。其次，在仔豬腸結(jié)扎試驗中，探討CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒對腸黏膜組織中細胞因子IL-6、IL-12和IFN-γmRNA水平的影響;在仔豬免疫試驗中，選取20

3、頭6周齡三元雜交仔豬，隨機分為5組進行首次免疫，一周后進行二次免疫，正常飼養(yǎng)，首免后42天宰殺，應用組織學切片技術(shù)檢測回腸CD3+T淋巴細胞、上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)的數(shù)目，以此評估CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對消化道局部細胞免疫水平的影響。另外，通過免疫組化技術(shù)檢測回腸組織中IgA分泌細胞的陽性面積，間接ELISA法檢測糞便和小腸組織中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平，探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對消化道局部

4、體液免疫水平的影響;通過檢測血清中豬傳染性胃腸炎病毒特異性IgG抗體水平來探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對全身體液免疫水平的影響。本研究內(nèi)容分為以下四個部分:
　　1 CpG對豬脾臟淋巴細胞的增殖刺激作用
　　用細菌CpG-DNA、人工合成的CpG-ODN、豬傳染性胃腸炎滅活病毒、CpG-DNA配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒刺激豬脾臟淋巴細胞72 h，檢測幾種處理對豬脾臟淋巴細胞的增殖作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):CpG-DNA和CpG-

5、ODN均能在體外72 h內(nèi)誘導豬脾臟淋巴細胞顯著增殖，且二者的刺激指數(shù)之間無顯著差異;CpG配合TGEV能刺激豬的脾臟淋巴細胞顯著增殖。本試驗結(jié)果表明CpG對豬脾臟淋巴細胞具有良好的免疫刺激作用，為后續(xù)的動物試驗提供了重要參考。
　　2豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對豬消化道局部細胞免疫水平的影響仔豬回腸結(jié)扎后注射豬傳染性胃腸炎滅活病毒和CpG，6h后宰殺采集回腸組織，應用實時熒光定量PCR的方法檢測IL-6、IL-12和IFN-

6、γ mRNA的表達量。結(jié)果表明:應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒，小腸中IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA水平顯著升高;單獨應用CpG也能增加IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA的表達水平;單獨應用豬傳染性胃腸炎滅活病毒不能使IL-6和IFN-γ mRNA水平增加，但能增加IL-12的mRNA表達量。
　　仔豬口服免疫后42天宰殺，采集回腸組織進行固定，石蠟包埋并制作組織學切片，應用免疫組化法顯示回腸CD3+T淋

7、巴細胞分布和數(shù)量變化，結(jié)果表明:應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著增加回腸絨毛處CD3+T淋巴細胞的數(shù)量。
　　應用HE染色法顯示豬回腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞分布和數(shù)量變化。結(jié)果表明:應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫后，回腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)目顯著增加。
　　以上三個試驗結(jié)果提示，應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫可有效誘導仔豬消化道局部細胞免疫應答。
　　3豬傳染性胃腸炎滅活病毒

8、口服免疫對豬消化道局部體液免疫水平的影響
　　應用免疫組化法顯示仔豬回腸IgA分泌細胞。結(jié)果表明:應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著增加仔豬回腸IgA分泌細胞的面積。
　　應用間接ELISA法每周監(jiān)測糞便中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平，結(jié)果表明:首免后前三周，應用CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著提高鼻糞便中特異性SIgA抗體水平;單獨應用豬傳染性胃腸炎滅活病毒也能顯著提高糞便中特

9、異性SIgA抗體水平，但效果不如CpG配合組。首免第四周時，口服免疫組中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平逐漸下降，各組之間無顯著差異。
　　應用間接ELISA法檢測回腸組織中特異性IgA抗體水平，結(jié)果表明:單獨應用豬傳染性胃腸炎滅活病毒或與CpG配合口服免疫45天后，回腸組織中特異性IgA抗體的水平仍顯著高于對照組;皮下注射豬傳染性胃腸炎滅活病毒組腸組織中特異性IgA抗體水平無顯著變化。
　　以上三個試驗結(jié)果提示，應

10、用CpG配合豬傳染性胃腸炎病毒口服免疫可有效誘導仔豬消化道局部體液免疫應答。
　　4豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對豬全身免疫水平的影響
　　應用間接ELISA法每周監(jiān)測血清中豬傳染性胃腸炎病毒特異性IgG抗體水平，結(jié)果表明:皮下注射TGEV滅活病毒組血清中IgG水平最高，且一直較穩(wěn)定;在免疫早期，CpG配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠顯著提高血清中特異性IgG抗體的水平，效果接近皮下注射組;單獨應用豬傳染性胃腸炎滅活