基于PDP-MCA的MVP分型技術(shù)及其在斑痕鑒別中的應(yīng)用.pdf

1、目的：本研究旨在探索新型法醫(yī)分子斑痕標(biāo)記及其檢測(cè)技術(shù)。首先建立一種簡便快速的基因組甲基化可變位點(diǎn)(Methylation variable position,MVP)分析技術(shù)--快速甲基化敏感性限制酶消化后PCR鏈融解曲線法(post fast-methylation sensitive restrictionenzymedigestion PCR melting curve analysis,PDP-MCA)，然后用該技術(shù)調(diào)查一組織特

2、異性 MVP在法醫(yī)學(xué)常見斑痕中的甲基化狀態(tài)，評(píng)價(jià)其作為斑痕標(biāo)記的可行性。
　　方法：PDP-MCA技術(shù)的建立與評(píng)價(jià)：以文獻(xiàn)報(bào)道的差異甲基化區(qū)(differentially methylated region,DMR)為模型，在MVP位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一組產(chǎn)物Tm值各不相同的引物。在同一反應(yīng)管內(nèi)，順次進(jìn)行基因組 DNA的 Fastdigest MSRE酶切、復(fù)合擴(kuò)增和鏈溶解曲線分析，Rotor-Gene2.0.2.4軟件分析數(shù)據(jù)生成MCA

3、圖譜，Origin8軟件進(jìn)行峰參數(shù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)各片段融鏈峰的面積和峰高比例判斷相應(yīng) MVP位點(diǎn)的甲基化水平。同時(shí)用 PDP-MCA和傳統(tǒng)的MSRE-PCR技術(shù)檢測(cè)相同的樣品，驗(yàn)證方法的可行性。組織特異性MVP作為法醫(yī)斑痕標(biāo)記的可行性：用上述 PDP-MCA技術(shù)調(diào)查法醫(yī)學(xué)常見斑痕(血斑、唾液斑、精斑各20份，月經(jīng)血斑、陰道液斑各12份)MVP位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，分析比較不同斑痕的 MCA/HRM圖譜，提取每個(gè)片段解鏈前后的標(biāo)準(zhǔn)熒光變

4、化值，用StatistiXL軟件對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，初步確立各種斑痕的判別方程。
　　結(jié)果：(1) Tm值相差2℃以上的4個(gè)片段，復(fù)合擴(kuò)增、復(fù)合MCA分析可以生成分離良好的融鏈峰，鏈融解曲線法可以代替電泳實(shí)現(xiàn)快速閉管檢測(cè)。利用甲基化敏感性的 FastDigest內(nèi)切酶，可以在同一反應(yīng)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速酶切、擴(kuò)增和MCA檢測(cè)，不同細(xì)胞有不同的MCA圖譜。與對(duì)照管相比較，組成酶切管MCA圖譜的各 MVP峰位置不變，峰高峰面積等參數(shù)呈組織

5、特異性變化。這種變化與傳統(tǒng)的 MSRE-PCR得到的結(jié)果一致，所反映的組織細(xì)胞甲基化特征也與文獻(xiàn)報(bào)道相符。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下，0.5 ng的基因組 DNA即可獲得穩(wěn)定的 MCA圖譜。加入的基因組DNA在0.5~20 ng之間，不影響圖譜的特異性。(2)用PDP-MCA檢測(cè)，血斑、唾液斑、精斑、月經(jīng)血斑、陰道液斑各有其特異性的 MCA圖譜， HRM差異曲線可以直觀的分出男性生殖斑痕(精斑)、女性生殖斑痕(月經(jīng)血斑和陰道液斑)、非生殖斑痕三大類

6、。對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，得到6個(gè)判別方程：Y血＝215.889X1＋351.518X2＋184.426X3＋187.220X4－8944.600， Y唾液＝218.104X1＋357.846X2＋185.441 X3＋189.631X4－9160.218，Y精液＝211.353 X1＋336.697X2＋181.563X3＋182.828X4－8479.036，Y陰道液＝212.469X1＋348.672X2＋180.079X3＋18

7、9.103X4－8702.051， Y月經(jīng)血＝214.026X1＋349.480X2＋182.364X3＋189.059X4－8812.421, Y對(duì)照＝209.004X1＋337.309X2＋178.322X3＋187.022X4－8367.215。訓(xùn)練樣本的總體判別準(zhǔn)確率為97.2％，除血斑(83.3%)外，其他斑痕的準(zhǔn)確率均為100%。
　　結(jié)論：(1) PDP-MCA可以實(shí)現(xiàn)多個(gè) MVP的一步單管、閉管檢測(cè)，是一種簡便快速