穩(wěn)定分泌抗羊種布魯菌脂多糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立.pdf

1、本研究將熱酚水法提純羊布魯菌(16M菌株)的脂多糖(LPS)和滅活羊種布魯菌(16M)作為免疫抗原,交替免疫6～8周齡Balb/c雌鼠。第一次免疫用羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌16M全菌加等量弗氏完全佐劑；第二次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐劑。第三次免疫用羊種布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌16M全菌(本次不加佐劑)；第四次用脂多糖(本次不加佐劑),每次免疫間隔十天。四免后,測(cè)其ELISA效價(jià)達(dá)到1:10000以上的,用脂多糖(LPS)抗原腹腔超強(qiáng)免疫一次,三天后取

2、小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
　　 用熱酚水法提純羊布魯菌(16M菌株)的脂多糖作為包被抗原建立間接ELISA方法,篩選抗羊種布魯菌(16M菌株)脂多糖的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。采用有限稀釋法,經(jīng)過(guò)3～4次克隆,最終獲得12株分泌抗羊種布魯菌脂多糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為:4A11、688、3H7、4D4、3E3、3F9、6E3、6F2、2C3、5D11、4C3、5H3。經(jīng)過(guò)亞類(lèi)鑒定,其中3E3和6

3、E3是IgG1亞類(lèi),3F9、2C3、5D11、3H7和4D4是IgG3亞類(lèi),4C3為IgG2a亞類(lèi),而6F2、5H3、688、4A11是IgM亞類(lèi)。選擇其中兩株雜交瘤細(xì)胞(4D4和3H7)進(jìn)行染色體分析,試驗(yàn)結(jié)果所得平均染色體數(shù)目在92～108之間,符合SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目與正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目之和,表明所獲得的抗體分泌細(xì)胞為雜交瘤細(xì)胞。對(duì)其中3株雜交瘤細(xì)胞(6B8、5H3和3H7)進(jìn)行特異性檢測(cè),結(jié)果顯示該3株單抗只與滅活

4、的羊種布魯菌16M裂解抗原發(fā)生反應(yīng),呈現(xiàn)陽(yáng)性；而不與大腸桿菌O157裂解抗原、雞白痢沙門(mén)菌裂解抗原、鴨源雞桿菌1-S脂多糖抗原以及福氏志賀菌解抗原反應(yīng)?；⒓t凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)此3株單抗具有很強(qiáng)的特異性。經(jīng)檢測(cè),所得12株抗羊種布魯菌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA效價(jià)在1:1000～1:10000之間,小鼠腹水單克隆抗體ELISA效價(jià)為1:160000。對(duì)其中5株雜交瘤細(xì)胞(688、3E3、3F9、6E3、6F2)進(jìn)