Bmi-1通過PTEN-PI3K-AKT通路調(diào)控白血病K562細(xì)胞的克隆形成及裸鼠成瘤能力.pdf

1、目的：白血病是一種造血干細(xì)胞異常的惡性克隆性疾病，一直以來都是困擾醫(yī)療界的一組死亡率極高的疾病，尤其是在兒童和青少年中。目前耐藥與治療后復(fù)發(fā)成為治療白血病的一大難題，有研究顯示，白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)因其相對靜止的狀態(tài)和較強(qiáng)的DNA修復(fù)和抵抗凋亡的能力，成為造成白血病患者治療失敗的主要原因。干細(xì)胞更新因子Bmi-1在多種腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)且對腫瘤的生命活動起到重要的調(diào)控作用，是介導(dǎo)白血病干細(xì)胞

2、自我更新能力的重要因子。本實(shí)驗(yàn)選取白血病K562作為實(shí)驗(yàn)對象，從PTEN/AKT信號通路入手，來探究Bmi-1基因調(diào)控白血病的增殖與自我更新的新途徑。
　　方法：1、本實(shí)驗(yàn)選用慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562作為研究對象，檢測K562細(xì)胞株中的Bmi-1基因表達(dá)情況。通過本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)構(gòu)建好的siRNA質(zhì)粒序列pGenesil-2-Bmi-11和pGenesil-2-Bmi-13，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，降低其中Bmi-1基因的表達(dá)，獲得兩

3、株細(xì)胞分別命名為K562-S1和K562-S3，以plasmids pGensil-1熒光序列作為對照轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞并命名為K562-CTR，通過western blot及RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測各組Bmi-1表達(dá)。2、降低K562細(xì)胞中Bmi-1基因的表達(dá)后，通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測Bmi-1基因?qū)562細(xì)胞自我更新的影響。3、western blot實(shí)驗(yàn)檢測Bmi-1基因沉默對PTEN/PI3K/AKT通路上相關(guān)蛋

4、白表達(dá)的影響。4、PI3K抑制劑LY294002降低K562細(xì)胞P-AKT的表達(dá)后，獲得K562-LY細(xì)胞，檢測該通路上相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，并檢測LY294002對K562細(xì)胞克隆形成與裸鼠成瘤能力的影響。5、將Bmi-1基因表達(dá)降低后的細(xì)胞用PTEN抑制劑Bpv處理，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)及克隆形成與裸鼠成瘤能力的變化。6、將收獲到的裸鼠腫瘤通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析其Bmi-1和Ki-67的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、western b

5、lot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bmi-1基因高表達(dá)于白血病細(xì)胞K562中，轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒序列pGenesil-2-Bmi-11和pGenesil-2-Bmi-13后K562-S1和K562-S3細(xì)胞的Bmi-1基因表達(dá)都受到抑制，且pGenesil-2-Bmi-11序列的抑制效果更明顯一些，所以選擇pGenesil-2-Bmi-11序列做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、增殖實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，K562細(xì)胞在降低Bmi-1基因的表達(dá)后，細(xì)胞

6、的增殖和克隆形成能力也降低，同樣pGenesil-2-Bmi-11序列的抑制效果更明顯一些，所以我們選擇K562-S1組細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)，通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，K562-S1組的裸鼠成瘤能力較K562組降低。3、western blot結(jié)果顯示，Bmi-1基因表達(dá)的降低，抑制了P-AKT的表達(dá)，PTEN的表達(dá)反而增高。說明Bmi-1的改變可以影響PTEN/PI3K/AKT通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)。4、PI3K抑制劑處理后的K562-LY細(xì)胞，

7、P-AKT表達(dá)降低，克隆形成和裸鼠成瘤能力也明顯下降。5、選擇合適的PTEN抑制劑濃度處理K562-S1細(xì)胞后，細(xì)胞PTEN的表達(dá)降低，卻激活了P-AKT的活性，同時K562-S1-B3組細(xì)胞的克隆形成和裸鼠成瘤能力相比較于K562-S1細(xì)胞有所增高。6、免疫組化結(jié)果顯示，裸鼠成瘤后的腫瘤組織中，Bmi-1基因的沉默使得腫瘤組織中Bmi-1與Ki-67表達(dá)均下降，Bmi-1與Ki-67蛋白的表達(dá)量與腫瘤的大小以及成瘤率呈正比，Ki-67