幾丁寡糖對(duì)脂肪酸代謝紊亂的抑制作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討幾丁寡糖（Chitin oLigosaccharide，NACOS）對(duì)機(jī)體脂代謝紊亂的抑制作用及其潛在的分子機(jī)制。
　　方法：
　　體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　?。?）MTT法篩選用藥濃度：分別采用濃度梯度的PA(0、25、50、100和200μM)預(yù)先作用24 h，MTT法用酶標(biāo)儀檢測HepG2細(xì)胞增殖的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，判斷最適PA濃度。將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS（0、50、100μg/mL）

2、預(yù)處理12 h后，加入PA處理24 h，MTT法檢測細(xì)胞存活率，判斷最適NACOS濃度。
　　（2）油紅O染色法：HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS（0、50、100μg/mL）預(yù)處理12 h后，再用PA刺激24 h。倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)，以此評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)所致的 HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)沉淀的影響以及NACOSA抑制HepG2細(xì)胞活化的最適濃度。
　?。?）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative ReaL

3、-time PCR）檢測HepG2細(xì)胞經(jīng)PA刺激不同時(shí)間后過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α（PGC1α）、炎癥因子IL-1β、乙酰輔酶A1（ACC1）、細(xì)胞色素氧化酶亞單位-5b（Cox5b）、中鏈?；o酶A脫氧酶（Mcad）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)PA對(duì)HepG2細(xì)胞的最適處理時(shí)間；將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS（100μg/mL）預(yù)處理12 h后，加入PA處理24 h，檢測過 PGC1α、IL-1β、ACC1、Cox5b、Mcad

4、的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂的抑制作用。
　?。?）免疫印跡法（Western bLot）檢測HepG2細(xì)胞經(jīng)PA不同時(shí)間刺激后MAPKs及PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶 p-p38、ERK1/2、Akt的蛋白磷酸化水平的變化，以評(píng)價(jià)PA對(duì)HepG2細(xì)胞的最適處理時(shí)間；將HepG2細(xì)胞經(jīng)NACOS（0、50、100μg/mL）預(yù)處理12 h后，再用PA刺激0.5 h，檢測MAPKs及PI3

5、K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶p-p38、p-ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化，以評(píng)價(jià)NACOS對(duì)PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂代謝紊亂的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組（n=5），即正常對(duì)照（normaL controL group，NCD）組、高脂飲食（high fat diet，HFD）組、NACOS組、NACOS+HFD組，造模20周，乙醚麻醉殺死小鼠，提取肝臟組織進(jìn)行檢查，用于制備組織勻漿。
　　主要

6、檢測方法如下：
　?。?）考察高脂模型C57BL/6小鼠在給予NACOS后各項(xiàng)生理指標(biāo)的的變化，如體重、飲水、飲食上的變化。
　　（2）RT-PCR方法檢測肝臟組織中過氧化物酶體增殖體受體共激活因子-1α、白介素因子1-β、乙酰輔酶A1、細(xì)胞色素氧化酶亞單位-5b、中鏈?；o酶A脫氧酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化。
　　（3）Western bLotting方法檢測MAPKs及PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白激酶p-p38、p-

7、ERK1/2、p-Akt的蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　?。?）MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明，PA在25-200μM范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞的活力沒有明顯的抑制作用，表明PA在該濃度下沒有細(xì)胞毒性，可在此濃度以下進(jìn)行體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)；NACOS100μg/mL可略微增加HepG2的活力，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且NACOS與PA聯(lián)合進(jìn)行藥物處理時(shí)亦沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用。
　?。?）油紅 O染色實(shí)驗(yàn)顯示，P

8、A處理后則細(xì)胞漿中的紅色脂肪顆粒呈顯著聚集趨勢。與PA單相比，NACOS預(yù)處理可明顯抑制PA誘導(dǎo)所致的HepG2細(xì)胞中脂滴的形成。
　?。?）RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞經(jīng)PA100μM處理3-24h后，PGC1α、IL-1β、ACC1、Cox5b、Mcad均表現(xiàn)出不同程度的升高（P<0.05或0.01），并在作用6 h后達(dá)峰值。
　　（4）Western bLotting結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)PA100μM

9、刺激后，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPKs）及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide3-kinase，PI3K；Protein kinase B，Akt）通路中的p38、ERK1/2、Akt激酶迅速激活，其磷酸化水平在0-1 h內(nèi)呈時(shí)間依賴性增加。其中，p-ERK1/2及p-Akt在0.5 h時(shí)達(dá)峰值（P<0.05，vs對(duì)照組），而p-p38則在1

10、 h時(shí)達(dá)最高水平（P<0.01，vs對(duì)照組）。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　（1）與給予基礎(chǔ)飼料的正常對(duì)照組（NCD）小鼠比較，高脂模型組（HFD）小鼠的平均體重顯著增加（P<0.01）。相反，當(dāng)高脂小鼠同時(shí)給予NACOS（1 mg/mL）處理時(shí)，可顯著抑制其體重的增加（P<0.05或0.01）。高脂飼料和或NACOS均對(duì)小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響。
　　（2）RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HFD組小鼠較NCD組小鼠

11、肝臟組織中PGC1α、ACC1及Mcad顯著升高（P<0.05或0.01），炎癥因子IL-1β亦增加明顯（P<0.05），但HFD處理對(duì)Cox5b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無顯著影響。與HFD組比較，小鼠經(jīng)NACOS處理后，其肝臟組織中脂代謝調(diào)控因子PGC1α、Mcad及ACC1的轉(zhuǎn)錄水平均不同程度地得到抑制（P<0.05或0.01），炎癥因子IL-1β亦顯著降低（P<0.05或0.01），Cox5b轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平變化不明顯。
　　（3）Weste

12、rn bLotting結(jié)果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠肝臟的p-p38、p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著增高（P<0.05），而p-ERK1/2則無明顯差別。與HFD組相比，MACOS可顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)所致p-p38及p-Akt的激活（P<0.01或0.05）。此外，NACOS亦可降低p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NACOS與PA聯(lián)合進(jìn)行藥物處理時(shí)沒

13、有表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用NACOS預(yù)處理明顯抑制PA誘導(dǎo)所致的HepG2細(xì)胞中脂滴的形成；NACOS抑制PA刺激引起的 HepG2細(xì)胞脂代謝的紊亂及相關(guān)炎癥因子的過表達(dá)；NACOS預(yù)處理顯著抑制p-p38、p-ERK1/2及p-Akt的表達(dá)水平。
　　（2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：高脂小鼠同時(shí)給予NACOS（1 mg/mL）處理時(shí)，可顯著抑制小鼠體重的增加，高脂飼料和或NACOS對(duì)小鼠的采食量及飲水量沒有明顯影響；NACOS處理可有效逆轉(zhuǎn)高脂