丁酸鹽減少IL-10基因敲除小鼠致腸炎的IgA包裹性細菌及改善腸道菌群結構.pdf

1、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種病變可涉及整個消化道的病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，病變主要累及末端回腸和結腸。盡管IBD的病因尚未明確，但普遍認為腸道內(nèi)菌群失調(diào)是IBD重要的發(fā)病機制之一。隨著科學技術的發(fā)展，菌群的培養(yǎng)及分析的方法日益先進，使人類對于腸道菌群的分析也更加精確，從而為人類對微生物的進一步了解打下堅定的基礎。而近年出現(xiàn)的分析細菌的16S rRN

2、A序列已經(jīng)成為細菌菌種鑒定方法的“金標準”。16S rRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長（包含約50個功能域）。隨著PCR技術的出現(xiàn)及核酸研究技術的不斷完善，16S rRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。數(shù)據(jù)庫的不斷完善，應用該技術可以實現(xiàn)對病原菌進行快速、微量、準確簡便地分類鑒定和檢測。
　　目前的研究發(fā)現(xiàn)

3、，IBD患者或動物實驗小鼠模型的腸道的菌群結構往往表現(xiàn)為菌群紊亂和生物多樣性的減少，如腸道內(nèi)厚壁菌門細菌和柔嫩梭菌比例比正常健康人群的細菌的比例低，而擬桿菌門細菌和腸桿菌科細菌的比例比正常人群的比例是有所增加的;更有發(fā)現(xiàn)某些特定的細菌可以使腸道的腸炎或結腸炎加重，如普雷沃什菌屬和螺桿菌屬，但是這卻并不具有普遍性的特點，往往個體性差異較大，將這種結果應用到其他個體是不太相同，甚至是相反的。因此，這種具體到某種細菌的結果又無法揭示炎癥性腸病

4、的病因。
　　直至近期，有研究發(fā)現(xiàn)存在一類細菌可與免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)結合并且被包裹，實驗將IBD患者的糞便中篩選并培養(yǎng)出這一類細菌，這種能夠被IgA包裹的細菌經(jīng)過灌胃后能夠使DSS誘導的無菌小鼠的結腸炎癥加重，而若是選用不能被IgA包裹的細菌灌胃后的這種小鼠卻沒有炎癥加重的現(xiàn)象。因此，這類被IgA包裹的細菌可能是導致炎癥性腸病的致病性細菌。IgA是一類主要在黏膜表面分泌且能與腸道微生物的片段結

5、合的一類抗體。IgA能夠調(diào)節(jié)機體的免疫力來抵抗腸道中的病原體，如病毒、細菌和毒素，也能對機體穩(wěn)態(tài)起到維持作用，研究發(fā)現(xiàn)缺乏IgA分泌的人類和小鼠更加容易患有IBD、乳糜瀉和過敏性疾病。IgA還通過調(diào)節(jié)機體共生菌群的組成、基因表達和菌群動力等作用來影響宿主腸上皮細胞的生理功能和免疫功能。由此可知，尋找可以減少IgA包裹性細菌的方法可能是作為治療IBD的一個有效手段。
　　飲食被認為是影響腸道菌群最重要的因素之一，故越來越多的研究想要

6、尋找出是否存在某些物質(zhì)或方法能夠使受到破壞的菌群結構重新建立，從而恢復機體正常菌群結構和保證機體健康。近些年來，新的方法不斷涌現(xiàn)，如糞菌移植，這是通過將健康人群的糞便細菌移植給一些菌群結構紊亂的患者中來治療患者的疾病的方法。此外，膳食纖維、益生元和益生菌也越來越受到人群和醫(yī)療結構的青睞，不僅作為健康產(chǎn)品，同時研究中的應用也更加廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，可溶性膳食纖維在IBD患者和動物模型中對于腸炎具有抗炎的作用，但背后的機制卻尚不明確。我們知道，

7、可溶性膳食纖維在結腸細菌的作用下可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸對于維持結腸的正常功能和結腸上皮細胞的形態(tài)和功能具有重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者及動物模型中產(chǎn)丁酸菌的數(shù)量與正常人群相比有明顯降低，同時伴隨著丁酸代謝和產(chǎn)量的減少。短鏈脂肪酸特別是丁酸可以通過調(diào)節(jié)結腸調(diào)節(jié)性T細胞的免疫功能起到抗結腸炎的作用。那么，丁酸能否對腸道菌群產(chǎn)生影響呢？從以上的研究和數(shù)據(jù)中我們可以發(fā)現(xiàn)丁酸確實是對腸道的炎癥、正常功能、

8、能量提供和免疫功能等產(chǎn)生影響的，但是產(chǎn)生這些影響的背后機制，特別是對腸道菌群的影響的具體研究卻是不多的。丁酸是否對于腸道的細菌的結構組成和生物多樣性產(chǎn)生作用，是否因此對產(chǎn)丁酸的菌群以及其他益生菌有影響，這些我們都不知道。本課題進行研究的初衷就是基于以上這些原因才產(chǎn)生的，希望能夠解答部分我們尚不知道的現(xiàn)象的原因。
　　目的：假設丁酸鹽可能通過影響腸道菌群的結構以及減少腸道內(nèi)致腸炎的IgA包裹性的細菌來減輕IBD動物模型IL-10基因

9、敲除小鼠的炎癥。
　　方法:我們選取8周齡的野生型C57BL/6小鼠4只及同樣周齡的IL-10基因敲除小鼠8只，將IL-10基因敲除小鼠隨機分成兩組，每組各4只。實驗組的IL-10基因敲除小鼠每天予喂食丁酸鹽(100mM)的水溶液;無干預措施組的IL-10基因敲除小鼠和空白對照組野生型小鼠均予喂食普通飲用水。在相同的飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)4周后處死并立即取結腸組織和結腸糞便進行相關的實驗。取各組小鼠的結腸組織用蘇木精-伊紅染色法染色以及免

10、疫熒光方法觀察結腸組織的炎癥，采用實時定量PCR方法檢測炎癥因子白介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-a的mRNA基因的相對表達來測定炎癥因子的表達水平;取各組小鼠的結腸糞便采用氣相色譜分析方法測定小鼠結腸糞便中短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的含量;采用16S rRNA基因測序的方法對各組小鼠結腸糞便的菌群結構進行分析;選用流式細胞術的方法對各組小鼠結腸糞便中Ig

11、A包裹性細菌的含量進行檢測。
　　結果:給予喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠的結腸組織炎癥比IL-10基因敲除小鼠無干預措施組的炎癥程度明顯減輕，同時結腸炎癥評分也明顯降低(1.25±0.50 vs.2.5±0.58分，p=0.025);炎癥指標IL-6和TNF-a表達水平在喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實驗組也明顯下降(分別9.71±1.15vs.12.92±1.64, p=0.006;8.17±0.79 vs.11.1

12、7±1.45, p=0.002)，和野生型小鼠對照組間卻沒有統(tǒng)計學差異（分別是p=0.388;p=0.285）;還有伴隨著小鼠結腸CD4+淋巴細胞數(shù)目的減低(14.00±2.94 vs.3.50±1.29，p＜0.001)。IL-10基因敲除小鼠無干預措施組和喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實驗組的糞便中的乙酸、丙酸和丁酸的含量明顯比野生型小鼠空白對照組的含量顯著增加（分別是乙酸:3.48±0.27 vs.0.76±0.16 ug/m

13、g，p＜0.001以及2.72±0.42 vs.0.76±0.16 ug/mg, p＜0.001;丙酸:0.78±0.18 vs.0.25±0.04 ug/mg, p=0.001以及0.75±0.17 vs.0.25±0.04 ug/mg，p=0.001;丁酸:1.57±0.60 vs.0.18±0.06 ug/mg, p=0.044和1.26±0.46 vs.0.18±0.06 ug/mg, p=0.042)。而IL-10基因敲除小鼠

14、無干預措施組糞便中的短鏈脂肪酸僅乙酸含量與喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實驗組有統(tǒng)計學差異(3.48±0.27 vs.2.72±0.42 ug/mg，p=0.006)，而丙酸及丁酸的含量卻沒有統(tǒng)計學差異（分別是p=0.800和p=0.792）。菌群分析發(fā)現(xiàn)在門的水平上，在喂食丁酸鹽的IL-10基因敲除小鼠實驗組中厚壁菌門的細菌的含量比IL-10基因敲除小鼠無干預措施組卻有了明顯地增加(32.86±1.47 vs.12.68±10.6

15、2％; p=0.012)，擬桿菌門細菌的含量下降(62.76±2.38 vs.81.07±13.51％，p=0.046)。在科的水平上，喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實驗組的乳酸桿菌科及Erysipelotrichaceae細菌含量卻升高了，雖然無統(tǒng)計學差異(分別是6.69±6.75 vs.0.98±0.42％，p=0.132和12.87±11.27 vs.2.38±2.65％，p=0.155)。在屬的水平上，喂食丁酸鹽后的IL-

16、10基因敲除小鼠實驗組的普雷沃什菌屬的細菌含量卻比無干預措施組小鼠的含量明顯降低了，雖然無統(tǒng)計學差異(18.79±16.18 vs.31.68±19.23％，p=0.219)。另外，喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實驗組的物種豐富度比IL-10基因敲除小鼠無干預措施組高（shannon指數(shù):3.22±0.29 vs.2.91±0.74，p=441;simpson指數(shù):0.09±0.02 vs.0.17±0.11，p=0.175），雖

17、然均無統(tǒng)計學差異。最后，IL-10基因敲除小鼠無干預措施組糞便中IgA包裹性細菌的含量比野生型小鼠和喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠實驗組的含量均明顯升高（分別是80.5±12.10 vs.54.8±2.12％, p=0.001和80.5±12.10 vs.44.7±0.92％,p＜0.001)，而野生型小鼠和喂食丁酸鹽后的IL-10基因敲除小鼠的糞便中IgA包裹性細菌的含量無統(tǒng)計學差異。
　　結論:IL-10基因敲除小鼠喂食