腸道共生菌感染基因敲除小鼠后黏膜免疫的變化及中藥成分的改善作用與機(jī)制研究.pdf

1、腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與腸道菌群、機(jī)體的遺傳因素和免疫反應(yīng)密切相關(guān)。腸道共生菌在一定條件下可以打破腸道內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)，誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物健康。腸道黏膜免疫系統(tǒng)在維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，探索腸道共生菌對(duì)腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。
　　大腸桿菌E.coli NC101和糞腸球菌E.faecalis是腸道共生菌，在人和動(dòng)物的腸道均可分離得到。當(dāng)機(jī)體免疫功能正常時(shí)，其與機(jī)體和

2、諧共存;如果機(jī)體的免疫功能發(fā)生異常（如缺乏IL-10），會(huì)引發(fā)異常的腸道黏膜免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉和腸炎。IL-10對(duì)調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)的平衡起著至關(guān)重要的作用。IL-10基因敲除小鼠是研究腸道黏膜免疫應(yīng)答的經(jīng)典動(dòng)物模型，其免疫系統(tǒng)在無(wú)菌環(huán)境中處于靜息狀態(tài)，但是在SPF環(huán)境中，在腸道共生茵的刺激下可以發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
　　本研究采用無(wú)菌級(jí)129品系野生型和IL-10基因敲除小鼠，開(kāi)展了E.coli NC101單一感染產(chǎn)

3、生的IL-10對(duì)機(jī)體腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制研究;探索了單一感染E.coli NC101對(duì)C57B6品系IL-10基因敲除小鼠造成的腸組織病理變化及免疫應(yīng)答狀況;研究了ATG16L1、MyD88和NOD2基因在單一感染E.coli NC101時(shí)對(duì)抗原遞呈功能的影響;并分別從體外、體內(nèi)入手，研究了中藥成分對(duì)自發(fā)性腸炎的改善作用及其黏膜免疫機(jī)制。
　　試驗(yàn)Ⅰ E.coH NC101感染活化機(jī)體產(chǎn)生的IL-10對(duì)黏膜免疫細(xì)胞因子

4、的調(diào)節(jié)作用研究
　　本試驗(yàn)選用129品系無(wú)菌級(jí)野生型小鼠和IL-10基因敲除小鼠，研究腸道共生茵E.coli NC101單一感染對(duì)激活機(jī)體免疫反應(yīng)，分泌細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用。首先進(jìn)行E.coli NC101單一感染，然后分別在感染前(0 d)，感染后4d、7d和30d，分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(MLN)，應(yīng)用E.coli NC101細(xì)菌裂解液10μg/mL刺激MLN，ELISA檢測(cè)IFN-γ的分泌量;同時(shí)分離脾臟淋巴細(xì)胞，應(yīng)

5、用E.coli NC101細(xì)菌裂解液10μg/mL刺激未分離的淋巴細(xì)胞，ELISA檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的分泌量，以及結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌產(chǎn)生的IL-12/23p40的水平。接著在129野生型小鼠單一感染E.coli NC101前，感染后4d、7d、14 d和30 d，分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞，應(yīng)用10μg/mL和1μg/mL的E.coli NC101細(xì)菌裂解液刺激MLN，ELISA檢測(cè)IFN-γ和IL-10的分泌

6、量;并檢測(cè)遠(yuǎn)端盲腸中IFN-γ和IL-10mRNA的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究IL-10對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，單一感染E.coli NC101后4d，在MLN培養(yǎng)時(shí)分別加入濃度為250 pg/mL、500 pg/mL、1000 pg/mL和2000 pg/mL的IL-10重組蛋白，檢測(cè)IL-10重組蛋白對(duì)MLN分泌IFN-γ的影響;并在單一感染E.coli NC101后7d和14d，通過(guò)在MLN培養(yǎng)時(shí)體外添加IL-10受體單克隆抗體阻斷IL-

7、10信號(hào)傳導(dǎo)通路，檢測(cè)其對(duì)MLN分泌IFN-γ的影響;同時(shí)進(jìn)行體內(nèi)阻斷IL-10信號(hào)傳導(dǎo)通路，ELISA檢測(cè)MLN分泌IFN-γ和IL-10的水平，及遠(yuǎn)端盲腸中IFN-γ和IL-10 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示:在單一感染的條件下，腸道共生菌E.coli NC101能夠激活129品系小鼠的腸道黏膜免疫應(yīng)答。野生型小鼠在單一感染4d時(shí)，IFN-γ在MLN和盲腸中的分泌與基因表達(dá)均達(dá)到最高水平，隨后顯著降低;IL-10基因敲除小鼠

8、在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均分泌大量IFN-γ。IFN-γ和IL-10 mRNA在盲腸中的表達(dá)與其在MLN中分泌水平的變化趨勢(shì)相同。體外添加IL-10重組蛋白可以降低IFN-γ在MLN中的分泌水平，體內(nèi)和體外阻斷IL-10信號(hào)傳導(dǎo)通路可以增加IFN-γ在MLN中的分泌水平。由此得出，單一感染腸道共生菌E.coli NC101的129小鼠在感染早期即可產(chǎn)生大量促炎癥細(xì)胞因子IFN-γ;單一感染刺激機(jī)體產(chǎn)生的IL-10，通過(guò)下調(diào)IFN-γ的分泌與

9、表達(dá)，參與調(diào)節(jié)E.coli NC101對(duì)腸道黏膜的免疫應(yīng)答。
　　試驗(yàn)Ⅱ單一感染E.coli NC101誘導(dǎo)C57B6 IL-10基因敲除小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)研究
　　應(yīng)用C57B6 IL-10基因敲除小鼠，每只小鼠通過(guò)灌胃給予0.2 mL菌液(OD600=0.9-1.0)，研究單一感染E.coli NC101對(duì)C57B6 IL-10基因敲除小鼠機(jī)體免疫反應(yīng)的影響。本試驗(yàn)在感染前(0 d)，感染后5w、10w、11w和12w分

10、別進(jìn)行組織學(xué)檢查，檢測(cè)單一感染是否對(duì)C57B6 IL-10基因敲除小鼠造成腸道損傷;同時(shí)檢測(cè)了未分離的脾臟淋巴細(xì)胞、腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞(MLN)在10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL的E.coli NC101細(xì)菌裂解液刺激下，炎性細(xì)胞因子的分泌量以及結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌IL-12/23p40的水平;并通過(guò)CD4+T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞APC共培養(yǎng)，檢測(cè)單一感染對(duì)C57B6 IL-10基因敲除小鼠腸道黏膜局部T細(xì)胞活化的影響。結(jié)

11、果顯示:在單一感染后5w、10w、11w和12w腸道組織學(xué)切片可見(jiàn)輕度的病理變化;腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌的IL-12/23p40在感染后各時(shí)間點(diǎn)與感染前相比差異顯著;單一感染后5w、10w、11w和12w，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，在不同濃度E.coli NC101細(xì)菌裂解液的刺激下，分泌的IFN-γ均顯著高于感染前，單一感染后各時(shí)間點(diǎn)MLN在E.coli NC101細(xì)菌裂解液的刺激下分泌產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-17，且各時(shí)間點(diǎn)分泌量均顯著高于

12、感染前的水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明:在單一感染的條件下，E.coli NC101可以激活C57B6 IL-10基因敲除小鼠的腸道黏膜和全身性免疫應(yīng)答，并對(duì)腸道組織造成輕度的病理變化。單一感染E.coli NC101后，結(jié)腸自發(fā)分泌的IL-12/23p40、脾臟淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、APC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)分泌的IFN-γ和IL-17顯著高于感染前。
　　試驗(yàn)Ⅲ ATG16L1、MyD88扣NOD2基因調(diào)節(jié)細(xì)胞抗原遞呈功能的比較研

13、究
　　本試驗(yàn)分別應(yīng)用C57B6背景的ATG16L1超等位基因小鼠、MyD88基因敲除小鼠和NOD2基因敲除小鼠，比較ATG16L1、MyD88和NOD2三種基因?qū)乖f呈功能的影響。試驗(yàn)分三個(gè)部分:(1)應(yīng)用條件致病性腸道共生菌E.coliNC101和非致病性腸道共生菌E.coli K12研究不同基因來(lái)源的脾臟巨噬細(xì)胞對(duì)活細(xì)菌的吞噬作用，及活細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)24 h和48 h的存活情況及存活率。研究結(jié)果顯示:E.coli NC1

14、01在ATG16L1超等位基因小鼠和MyD88基因敲除小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率與E.coli K12相比，存在顯著差異;而在NOD2基因敲除小鼠中則沒(méi)有差異;與野生型小鼠相比，E.coli NC101在ATG16L1超等位基因小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率顯著高于其在野生型小鼠的存活率。(2)分離E.coli NC101單一感染的C57B6 IL-10基因敲除小鼠腸系膜淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞，并將上述三種不同基因小鼠脾臟抗原遞呈細(xì)胞APC

15、與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)ELISA檢測(cè)其分泌產(chǎn)生的IFN-γ和IL-17含量，來(lái)比較這些基因工程小鼠抗原遞呈功能與野生型小鼠的異同。結(jié)果顯示:三種不同基因來(lái)源的脾臟APC和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)分泌產(chǎn)生的IFN-γ和IL-17與野生型小鼠相比，沒(méi)有顯著差異。(3)基于上述試驗(yàn)結(jié)果，選取骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)和樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)，進(jìn)一步研究ATG16L1超等位基因小鼠與野生型小鼠抗原遞呈功能的異同。分別用活細(xì)菌E.coli

16、NC101刺激2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔、5.0×105個(gè)細(xì)胞/孔、7.5×105個(gè)細(xì)胞/孔和10.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的BMDM，以及2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔和5.0×105個(gè)細(xì)胞/孔的BMDC，通過(guò)ELISA檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的水平。研究結(jié)果表明:BMDM在活細(xì)菌E.coli NC101的刺激下分泌產(chǎn)生大量的IL-10;其中，來(lái)源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDM分泌產(chǎn)生的I

17、L-10在各時(shí)間點(diǎn)均大于野生型，培養(yǎng)8h時(shí)各細(xì)胞濃度的分泌量均差異顯著;IL-12的分泌量在各時(shí)間點(diǎn)均小于野生型，培養(yǎng)12h時(shí)各細(xì)胞濃度的分泌量均差異顯著;而TNF-α的分泌量只有當(dāng)細(xì)胞量為10.0×105個(gè)/孔，培養(yǎng)6h時(shí)，顯著高于野生型小鼠的分泌量。BMDC在活細(xì)菌E.coli NC101的刺激下分泌產(chǎn)生大量IL-12;培養(yǎng)8h時(shí)來(lái)源于ATG16L1超等位基因小鼠的BMDC分泌產(chǎn)生的IL-12顯著低于野生型，而IL-10和TNF-α

18、的分泌量則與野生型小鼠沒(méi)有差異。以上試驗(yàn)結(jié)果表明:ATG16L1基因功能損傷，可以增加細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的存活率，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞活化，分泌細(xì)胞因子IL-10和IL-12。
　　試驗(yàn)Ⅳ苦參堿對(duì)IL-10基因敲除小鼠自發(fā)性腸炎的治療作用及其黏膜免疫機(jī)制研究
　　本研究應(yīng)用SPF級(jí)別129 SvEv品系IL-10基因敲除小鼠，探討苦參堿是否可以減輕自發(fā)性腸炎的癥狀及其黏膜免疫機(jī)制。自發(fā)產(chǎn)生腸炎的IL-10基因敲除小鼠，每天

19、灌胃給予濃度為10 mg/kg苦參堿，對(duì)照組灌胃給予PBS對(duì)照，持續(xù)4w，每周檢測(cè)小鼠體重變化。小鼠分別在2w和4w處死，測(cè)量小鼠體重、結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸重量、組織學(xué)炎癥評(píng)分;檢測(cè)結(jié)腸自發(fā)分泌的IL-12/23p40、IFN-γ和IL-17的分泌量;腸系膜淋巴細(xì)胞在盲腸菌群裂解物刺激后IFN-γ和IL-17的分泌量;以及遠(yuǎn)端結(jié)腸中IFN-γ、 IL-17，IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)。此外，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了腸系膜T淋巴細(xì)胞中CD

20、4+和CD8+細(xì)胞所占比例。結(jié)果顯示:苦參堿組小鼠的體重逐漸恢復(fù)，腸道組織學(xué)炎癥評(píng)分和結(jié)腸組織培養(yǎng)自發(fā)分泌的IL-12/23p40、IFN-γ和IL-17量顯著低于對(duì)照組小鼠?？鄥A組小鼠腸系膜淋巴細(xì)胞中CD4+所占比例顯著低于對(duì)照組。此外，苦參堿組小鼠IFN-γ和IL-17在結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明:苦參堿對(duì)于IL-10基因敲除小鼠自發(fā)性腸炎有良好的治療作用，苦參堿通過(guò)調(diào)整機(jī)體腸道黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮其