Klotho抑制CKD炎癥狀態(tài)的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：
　　慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率、住院率和死亡率逐年升高，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著CKD的逐漸進(jìn)展，除了累及腎臟，還可以累及其它器官，并最終發(fā)展為終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)。因此，延緩CKD的進(jìn)展，并尋找新的治療靶點(diǎn)變得尤為重要。
　　本文擬采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent ass

2、ay，ELISA)檢測CKD患者血清中Klotho水平及炎癥因子水平，以明確CKD患者中Klotho水平和炎癥因子之間的關(guān)系;并通過體外研究探討Klotho抑制IS誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎癥因子釋放的作用和機(jī)制，為CKD及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展尋找新的防治靶點(diǎn)。
　　方法：
　　一、在體研究：
　　1.臨床研究：收集CKD2-5期286例非透析患者的血清樣本，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測Klotho水平及炎癥因子CRP、I

3、L-6、TNF-α水平，高效液相色譜法檢測IS水平。對炎癥因子(CRP、IL-6、TNF-α)、Klotho水平及IS進(jìn)行單因素方差分析;炎癥因子與eGFR、Klotho、IS相關(guān)性采用等級相關(guān)（Spearman）分析;偏相關(guān)分析（控制白蛋白與血磷）炎癥因子與Klotho的相關(guān)性。
　　2.人體樣本：選取健康志愿者和CKD5期非透析患者各5人，采集其晨起空腹外周靜脈血，靜置離心后取血清樣本，提取單核細(xì)胞（釋放炎癥因子的單核-巨噬系

4、統(tǒng)在外周血中主要為單核細(xì)胞，在組織中主要為巨噬細(xì)胞），westernblot檢測兩組人群單核細(xì)胞中炎癥信號分子的表達(dá)差異。所有試驗(yàn)參與者均簽署知情同意書，本研究獲得第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。本研究按照赫爾辛基宣言和倫理審查流行病學(xué)研究的國際準(zhǔn)則來進(jìn)行。
　　二、體外研究：
　　1.IS誘導(dǎo)人單核細(xì)胞（Human acute monocytic leukemia cell line，THP-1）炎癥因子釋放的作用

5、和機(jī)制（三組實(shí)驗(yàn)）：
　?、袤w外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞按如下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Control組、2mg/L IS組、10mg/LIS組、50mg/L IS組。上述各組細(xì)胞在含有相應(yīng)濃度IS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24h后提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測RIG-Ⅰ和pNF-κB的表達(dá)變化，同時(shí)real-timequantitative PCR(qPCR)和ELISA測定細(xì)胞和上清中TNF-αmRNA和蛋白水平。
　?、赥HP-

6、1細(xì)胞按以下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Control組、IS組（含50mg/L IS）、PDTC組（含10μM PDTC）、IS+10μM PDTC組（10μM PDTC預(yù)處理1h后加入50mg/L IS繼續(xù)孵育24h）。Western Blot再次檢測各組細(xì)胞pNF-κB蛋白表達(dá)，qPCR和ELISA測定細(xì)胞和上清中TNF-αmRNA和蛋白水平。
　?、跿HP-1細(xì)胞分以下6組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Control組、IS組、Con siRNA組、RIG

7、-ⅠsiRNA組、IS+Con siRNA組、IS+RIG-ⅠsiRNA組。上述分組在50mg/L IS孵育24h后，WesternBlot測定各組細(xì)胞中pNF-κB蛋白表達(dá)，qPCR和ELISA測定細(xì)胞和上清中TNF-αmRNA和蛋白水平。
　　2.Klotho對IS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用：
　　THP-1細(xì)胞按以下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Control組、IS組（含50mg/L IS）、Klotho組（含400p

8、mol/L Klotho）、IS+Klotho組（含400pmol/L Klotho的培養(yǎng)基預(yù)孵育細(xì)胞1h后，加入50mg/L IS繼續(xù)培養(yǎng)24h）。Western Blot檢測4組細(xì)胞RIG-Ⅰ和pNF-κB蛋白表達(dá)，qPCR和ELISA測定細(xì)胞和上清中TNF-αmRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.CKD患者血清Klotho蛋白水平與炎癥因子相關(guān)性分析
　　本項(xiàng)研究共招募原發(fā)性CKD2-5期非透析患者286例、

9、5名健康志愿者及5名CKD5期非透析患者。依據(jù)2007美國腎臟病基金會(KDOQI)腎功能分期標(biāo)準(zhǔn)將CKD分為5期。其中CKD2期36例，CKD3期51例，CKD4期55例，CKD5期144例。CKD分期與性別、年齡、BMI及ALB等無關(guān)(P＞0.05）。臨床樣品的檢測表明：隨著CKD分期的進(jìn)展，患者血清CRP、IL-6、TNF-α水平和IS濃度逐漸升高，而Klotho蛋白水平逐漸降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：①Tukey多重比較檢驗(yàn)的單因素方

10、差分析提示CKD患者隨著eGFR降低，血清CRP、IL-6、TNF-α及IS水平逐漸升高（P＜0.01），Klotho蛋白含量逐漸降低（P＜0.01）。②等級相關(guān)(Spearman)分析提示，CRP、TNF-α、IL-6與eGFR及Klotho呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與IS呈正相關(guān)（P＜0.01），血清Klotho與eGFR呈正相關(guān)（P＜0.001），血清中IS與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001)。③偏相關(guān)分析（控制變量為ALB及血磷

11、）提示，Klotho與TNF-α仍具有顯著相關(guān)性(P＜0.001)，而IL-6和CRP與Klotho的相關(guān)性減弱（P＜0.001）
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果及探討其中的可能機(jī)制，本項(xiàng)研究采用CD14+磁珠分選方法提取5名健康志愿者和5名CKD（5期）患者血清中單核細(xì)胞進(jìn)行檢測。Western Blot檢測表明，與健康人相比，CKD患者單核細(xì)胞RIG-1、pNF-κB和TNF-α表達(dá)水平均顯著上升。同時(shí)，ELISA檢測結(jié)果也表明C

12、KD患者的CRP、IL-6、TNF-α水平較健康志愿者明顯增加。這些結(jié)果提示CKD5期患者單核細(xì)胞處于活化狀態(tài)，炎癥因子釋放增加，且可能與與RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路被激活相關(guān)。
　　2.IS誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎癥因子釋放的作用及其分子機(jī)制
　　為了檢測IS是否可以引起THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)，本研究使用含有0、2mg/L、10mg/L、50mg/L濃度IS的培養(yǎng)基孵育THP-1細(xì)胞24小時(shí)，real-time qPCR檢測細(xì)胞

13、中TNF-αmRNA表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α的蛋白水平。
　　結(jié)果表明：IS可以增強(qiáng)THP-1細(xì)胞炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，培養(yǎng)上清中的TNF-α蛋白水平也明顯增加，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。與此同時(shí)，Western Bolt檢測提示，IS可以劑量依賴性的上調(diào)RIG-Ⅰ和pNF-κB的蛋白表達(dá)，說明IS導(dǎo)致了THP-1細(xì)胞RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路活化。為進(jìn)一步研究IS是否通過激活該信號通路誘導(dǎo)了THP-1細(xì)胞炎癥

14、因子釋放，首先采用NF-κB的特異性抑制劑PDTC預(yù)孵育THP-1細(xì)胞，然后再加入IS孵育，并再次檢測炎癥因子TNF-α的表達(dá)。
　　結(jié)果表明，與IS組相比，PDTC預(yù)孵育可明顯抑制IS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞pNF-κB表達(dá)增高，并減少TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)。然后采用特異性的siRNA抑制RIG-Ⅰ表達(dá)后再加入IS孵育細(xì)胞。
　　結(jié)果表明，與IS+consiRNA組相比，IS+RIG-ⅠsiRNA組細(xì)胞的的pNF-κB表

15、達(dá)顯著下降，并且，THP-1細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)明顯降低，分泌至培養(yǎng)上清中的TNF-α蛋白水平也顯著下降。這些結(jié)果說明，IS通過激活RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路誘導(dǎo)了THP-1細(xì)胞炎癥因子的釋放。
　　3.Klotho抑制IS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子釋放
　　為了檢測外源性Klotho是否可以抑制THP-1細(xì)胞RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路活化和炎癥因子釋放，本研究利用Klotho預(yù)孵育THP-1細(xì)胞1小時(shí)后，再

16、加入50mg/L IS孵育細(xì)胞24h。
　　結(jié)果表明，與IS組相比，Klotho可以明顯抑制IS誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ和pNF-κB表達(dá)增加，提示Klotho可以抑制IS所引起的RIG-Ⅰ/pNF-κB信號通路活化;并且，IS引起的TNF-α水平升高也明顯被Klotho逆轉(zhuǎn)。這表明外源性Klotho可以抑制IS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路活化及隨之引發(fā)的炎癥因子釋放。
　　結(jié)論：
　　1、CKD患者隨著

17、eGFR的降低，血清Klotho水平與炎癥因子水平呈顯著負(fù)相關(guān)，而IS水平與炎癥因子水平呈顯著正相關(guān)，并且CKD5期非透析患者循環(huán)中單核細(xì)胞RIG-Ⅰ/NF-κB炎癥信號通路顯著活化。
　　2、蛋白結(jié)合毒素IS可通過激活RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)與釋放。
　　3、外源性Klotho蛋白可以通過通過抑制RIG-Ⅰ/NF-κB信號通路減輕IS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)與釋放。。