慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕邊界定位的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是目前公認(rèn)的疑難病之一，它具有高致殘率、高耗費(fèi)、患者主要為青壯年等特點(diǎn)，對(duì)受害者是災(zāi)難性事故。如何修復(fù)損傷脊髓及恢復(fù)損傷脊髓的功能目前仍沒有有效的對(duì)策，究其原因在于成熟中樞神經(jīng)再生困難，但近年來對(duì)脊髓再生的一系列的實(shí)驗(yàn)研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。許多新的方法如神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長(zhǎng)抑制因子阻滯劑，電刺激，神經(jīng)移植包括周圍神經(jīng)移植、胚胎脊髓移植、神經(jīng)干細(xì)胞移植、嗅鞘細(xì)胞移植，基因治療等均可

2、使成年動(dòng)物表現(xiàn)出某種程度的恢復(fù)，其中，目前被認(rèn)為最有研究前途的是應(yīng)用附有神經(jīng)干細(xì)胞及各種神經(jīng)生長(zhǎng)因子的神經(jīng)再生管（一種可吸收的生物工程材料）進(jìn)行移植治療脊髓損傷。 但是，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，會(huì)啟動(dòng)一系列與形成瘢痕組織相關(guān)的細(xì)胞及分子間的反應(yīng)，最終形成以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的瘢痕組織，環(huán)繞著的充滿組織液的囊泡。這種致密的膠質(zhì)瘢痕（glial scar）包裹損傷區(qū)，從而把損傷區(qū)與周圍正常組織分隔開。中樞受損纖維與周圍神經(jīng)一樣可以再生，但

3、再生的效果卻有很大的差別，成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的軸突一般生長(zhǎng)2周便停止，不會(huì)超過1mm距離，被稱為“流產(chǎn)的再生”（abortive regeneration），其再生的軸突往往不能越過損傷區(qū)的膠質(zhì)瘢痕，即使能越過也生長(zhǎng)不到遠(yuǎn)處，與突觸后神經(jīng)元建立功能性連接。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)出現(xiàn)的膠質(zhì)瘢痕，好像一道致密的屏障，使再生軸突不容易通過，是造成中樞神經(jīng)再生流產(chǎn)的主要因素。此外，膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突再生的影響除了空間阻礙等物理因素外，由瘢痕細(xì)

4、胞分泌的蛋白多糖（如硫酸軟骨素蛋白多糖等）在損傷區(qū)的堆積也是抑制軸突再生的重要因素。因此，膠質(zhì)瘢痕和空洞的存在嚴(yán)重影響著再生軸突通過脊髓損傷部位，使脊髓損傷近端再生的中樞軸突在此處失去引導(dǎo)而到達(dá)不了脊髓損傷的遠(yuǎn)端，不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的修復(fù)。故而克服膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突再生的阻礙作用是促進(jìn)神經(jīng)再生和功能修復(fù)的先決條件。因此，在進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷之前，必須對(duì)脊髓損傷所產(chǎn)生的瘢痕組織進(jìn)行完整切除，移植的神經(jīng)干細(xì)胞的軸突方有可能沿伸到脊髓

5、瘢痕兩側(cè)的上、下級(jí)神經(jīng)元，重新建立神經(jīng)通路，以期達(dá)到重新修復(fù)已離斷神經(jīng)傳導(dǎo)束的功能，恢復(fù)患者的正常生活。 為了能夠?qū)⒙约顾钃p傷的瘢痕組織精確、完整地切除，同時(shí)盡量避免對(duì)正常脊髓的過度切除，以免在誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞軸突生長(zhǎng)到能夠連接瘢痕雙側(cè)的神經(jīng)軸突造成額外的困難。因此，對(duì)慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕邊界定位的研究變得非常重要。 MRI掃描可以反映脊髓內(nèi)不同組織信號(hào)的差別，通過對(duì)慢性脊髓損傷脊髓進(jìn)行MRI掃描，檢測(cè)脊髓內(nèi)信號(hào)的變化

6、情況，借以了解正常脊髓與膠質(zhì)瘢痕組織之間的信號(hào)差別，幫助辨別膠質(zhì)瘢痕組織的邊界。 其中，最重要的是本實(shí)驗(yàn)引入了立體定向定位原理，借以幫助對(duì)膠質(zhì)瘢痕邊界進(jìn)行定位。擬定某個(gè)節(jié)段的脊柱椎板后正中下緣為擬定的原點(diǎn)”O(jiān)”點(diǎn)，通過分別測(cè)量MRI矢狀位上慢性脊髓損傷節(jié)段異常信號(hào)上、下端點(diǎn)A、B到達(dá)“O”點(diǎn)的距離并記錄。在切除瘢痕組織術(shù)中可根據(jù)術(shù)前檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)瘢痕邊界進(jìn)行定位。 超聲在臨床已得到廣泛的應(yīng)用，尤其是在神經(jīng)外科領(lǐng)域，在糾正神經(jīng)

7、導(dǎo)航中應(yīng)用價(jià)值得到肯定，而且分辨率高，同時(shí)具有實(shí)時(shí)糾正的特點(diǎn)。因此，在本研究中我們嘗試引入超聲檢查對(duì)脊髓損傷的膠質(zhì)瘢痕范圍進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)，希望能夠在瘢痕范圍的定位中減少誤差。 本課題研究主要內(nèi)容是：用畢格犬脊髓半截?cái)嗟姆椒ń⒓顾璋虢財(cái)嗟穆约顾钃p傷膠質(zhì)瘢痕的動(dòng)物模型，然后，應(yīng)用MRI掃描對(duì)慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕的動(dòng)物脊髓進(jìn)行檢查，了解損傷節(jié)段及其上、下的磁共振信號(hào)變化情況，同時(shí)引入立體定向定位系統(tǒng)，即擬定損傷節(jié)段上一節(jié)椎板后正中

8、下緣為擬定的原點(diǎn)“O”點(diǎn)，通過分別測(cè)量MRI矢狀位上慢性脊髓損傷節(jié)段異常信號(hào)上、下端點(diǎn)A、B到原點(diǎn)的距離記為AO、BO，AB的長(zhǎng)度即是影像學(xué)上異常信號(hào)的長(zhǎng)度。MRI掃描后，在對(duì)慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕的動(dòng)物脊髓進(jìn)行超聲檢查，了解損傷節(jié)段脊髓及其上、下范圍脊髓的磁共振信號(hào)變化情況，幫組分辨瘢痕組織的范圍。最后，通過脊髓標(biāo)本矢狀位切片染色明確瘢痕組織在脊髓內(nèi)的真實(shí)范圍，探索影像學(xué)上異常信號(hào)上、下端到原點(diǎn)的距離與病理學(xué)證實(shí)的實(shí)際瘢痕上、下端點(diǎn)到原

9、點(diǎn)距離之間差異的規(guī)律，借以指導(dǎo)在干細(xì)胞移植治療慢性脊髓損傷中精確切除瘢痕組織。 第一部分半截?cái)嗦约顾钃p傷膠質(zhì)瘢痕模型的建立。 目的：構(gòu)建半截?cái)嗦约顾钃p傷膠質(zhì)瘢痕模型，為后續(xù)進(jìn)一步對(duì)慢性脊髓損傷瘢痕組織進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)。 方法：選定胸8-9椎體節(jié)段脊髓作為建立半截?cái)嗟募顾钃p傷模型部位，顯露胸第7-9胸椎椎板，椎板咬骨鉗小心咬除第8-9胸椎椎板，保留第7胸椎椎板完整性，后正中剪開硬脊膜，顯露脊髓。擬定第7椎板后正

10、中下緣為原點(diǎn)，在距離原點(diǎn)向下約5mm、15mm的地方半橫斷切開脊髓，然后，于脊髓后正中切開已在上下端離斷的脊髓節(jié)段，形成半截?cái)嗟募顾钃p傷模型（手術(shù)刀尖緊貼腹側(cè)硬脊膜，保證脊髓損傷確切）。手術(shù)后動(dòng)物患側(cè)下肢軟癱。為除外殘留纖維的可能，抬起斷端以確定其完全離斷。通過行為學(xué)方法對(duì)模型的建立進(jìn)行評(píng)估。后續(xù)的影像學(xué)檢查對(duì)模型進(jìn)一步核查，確定模型成功建立。 結(jié)果：成功建立大動(dòng)物-畢格犬脊髓半截?cái)嗦约顾钃p傷膠質(zhì)瘢痕模型，經(jīng)影像學(xué)及后續(xù)的病理

11、學(xué)證實(shí)，瘢痕范圍廣，適合于本實(shí)驗(yàn)研究需要。 結(jié)論：用半截?cái)嗟姆椒ń⒌募顾钃p傷模型，脊髓損傷確切，形成瘢痕范圍大，是研究慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕邊界的好模型。 第二部分 MRI掃描慢性損傷脊髓。 目的：測(cè)量脊髓異常信號(hào)上、下端點(diǎn)到擬定原點(diǎn)的距離，初步確定異常組織的范圍。 方法：畢格犬脊髓損傷后飼養(yǎng)3個(gè)月以上，予損傷節(jié)段脊髓的瘢痕組織充分生長(zhǎng)，形成成熟的慢性脊髓損傷模型。然后，應(yīng)用MRI對(duì)慢性脊髓損傷的畢格犬進(jìn)

12、行脊髓掃描，觀察脊髓異常信號(hào)的范圍。 結(jié)果：MRI掃描提示，損傷區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，前后徑明顯變小，損傷脊髓節(jié)段表現(xiàn)為T1WI低信號(hào)，T2WI表現(xiàn)為高信號(hào)，與正常脊髓之間的邊界均清晰，同時(shí)，矢狀位上能同時(shí)清晰顯示手術(shù)創(chuàng)面上骨窗上下端椎板上下緣、損傷脊髓的異常信號(hào)及其邊界，MRI掃描上縱軸異常信號(hào)的平均長(zhǎng)度為14．70mm。 結(jié)論：MRI掃描圖像清晰，脊髓膠質(zhì)瘢痕、正常脊髓及骨性組織在信號(hào)上差異明顯，可根據(jù)異常信號(hào)范圍初步判斷脊髓

13、膠質(zhì)瘢痕與正常脊髓之間的邊界。 第三部分應(yīng)用B超對(duì)脊髓的異常信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。 目的：探討超聲檢查在慢性脊髓損傷膠質(zhì)瘢痕邊界定位中的應(yīng)用價(jià)值 方法：慢性脊髓損傷模型建立后3個(gè)月后，（MRI掃描后）打開原手術(shù)切口，顯露脊髓后應(yīng)用超聲檢查對(duì)損傷節(jié)段脊髓進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：測(cè)量顯示，B超檢測(cè)能分辨脊髓上的異常信號(hào)變化，而且信號(hào)變化明顯、邊界清晰，達(dá)到肉眼分辨水平。超聲檢查具有實(shí)時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，能在切除瘢痕組織術(shù)中實(shí)時(shí)檢

14、查瘢痕組織是否已完全切除；但是超聲的分辨率有限，而且，超聲檢測(cè)缺乏穩(wěn)定性，目前可通過提高頻率來達(dá)到提高超聲的分辨率。 結(jié)論：在應(yīng)用MRI掃描的基礎(chǔ)上，超聲檢測(cè)可以作為輔助手段幫助初步判斷瘢痕組織是否已完全切除。 第四部分、對(duì)損傷節(jié)段脊髓進(jìn)行病理染色并測(cè)量膠質(zhì)瘢痕的范圍。 目的：證實(shí)MRI上異常信號(hào)區(qū)域?yàn)槟z質(zhì)瘢痕組織，并測(cè)量膠質(zhì)瘢痕的范圍，計(jì)算其上、下端點(diǎn)到擬定原點(diǎn)的距離。 方法：處死實(shí)驗(yàn)犬，灌注固定脊髓標(biāo)

15、本，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白染色，再測(cè)量膠質(zhì)瘢痕上、下端點(diǎn)到原點(diǎn)的距離。 結(jié)果：神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）免疫組化染色后的慢性損傷脊髓切片上可清晰看到膠質(zhì)瘢痕組織被染成淡黃色，膠原組織較正常脊髓組織染色深，邊界清晰，膠原組織與正常脊髓的邊界為不平整的鋸齒狀的連接面。膠質(zhì)瘢痕縱向的平均長(zhǎng)度為18．6 MM，較MRI掃描上縱軸異常信號(hào)的平均長(zhǎng)度長(zhǎng)3．9mm。 結(jié)論：MRI的實(shí)際分辨率有限，只能初步判斷膠質(zhì)瘢痕組織的范圍，