姜黃素抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的機制及其對神經(jīng)再生的影響.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)引起的神經(jīng)功能缺失和缺乏有效的治療手段，一直是對人類健康的極大挑戰(zhàn)。脊髓損傷后，膠質(zhì)瘢痕修復(fù)損傷部位，但過度增生的瘢痕組織被認(rèn)為是阻礙軸突再生的重要原因，且與炎癥細胞的激活以及抑制性細胞外基質(zhì)的分泌密切相關(guān)。星形膠質(zhì)細胞受到炎癥因子激活后形成反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生并導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的形成，膠質(zhì)瘢痕又可以分泌炎癥因子和細胞外抑制性基質(zhì)成分，加重了繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致惡性循環(huán)。因此，抑制膠質(zhì)瘢痕的

2、形成是提高脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的重要策略。
　　取自姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃干燥梗莖中的姜黃素(curcumin，cur)，作為香料和食用色素很早就得到了廣泛應(yīng)用。大量的研究證實，姜黃素能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、趨化因子、炎癥因子和酶等發(fā)揮抗炎、抗纖維化、抗腫瘤等生物學(xué)功能。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，但其作用機制和作用靶點仍需要進一步探討。
　　炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性脊髓損傷的重要因素。小膠質(zhì)細胞

3、作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細胞，在脊髓損傷后迅速激活并持續(xù)分泌促炎因子，是介導(dǎo)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的重要成分。抑制小膠質(zhì)細胞的激活可以顯著提高實驗動物脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)。姜黃素能抑制顱腦損傷后的小膠質(zhì)細胞的活性，但其在脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞活化中的作用缺乏深入的研究。炎癥反應(yīng)還和神經(jīng)干細胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)的增殖與分化密切相關(guān)。抑制炎癥反應(yīng)可以促進NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞

4、。
　　基于以上理論，我們進行了如下假設(shè):姜黃素能抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，脊髓損傷后其發(fā)揮強大的抗炎作用，有助于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。控制脊髓損傷的炎癥反應(yīng)能改善NSPCs生長的環(huán)境，這對NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞具有積極作用。本課題從以下幾個方面進行了研究。
　　一.姜黃素抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成
　　目的：
　　脊髓損傷能激活膠質(zhì)細胞并使其腫脹、增殖，形成反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生，

5、嚴(yán)重壓縮了神經(jīng)生長的空間。膠質(zhì)細胞還會分泌大量抑制性細胞外基質(zhì)，改變軸突生長的微環(huán)境。這些共同作為膠質(zhì)瘢痕的抑制因素，嚴(yán)重阻礙了神經(jīng)再生。本研究通過建立脊髓損傷模型后給予姜黃素干預(yù)，檢測其對膠質(zhì)瘢痕的作用。
　　方法:
　　1.采用SD大鼠建立脊髓夾傷模型，給予不同濃度姜黃素(300mg/kg、100 mg/kg、30 mg/kg)連續(xù)干預(yù)7天，并以甲基強的松龍作為對照;
　　2.在損傷8周后，采用BBB評分、斜板實驗

6、和BDA染色評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況;
　　3.在損傷8周后，通過HE染色和MRI檢測不同干預(yù)條件下脊髓空洞體積;
　　4.在損傷2周后，采用免疫組織化學(xué)染色觀察了膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)外成分膠原纖維酸性蛋白(GFAP)和硫酸軟骨蛋白多糖(CSPG)表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.姜黃素處理組中BBB評分、斜板實驗和BDA染色均優(yōu)于對照組，并且隨著濃度增加效果增強，姜黃素300mg/kg實驗組效率最好;
　　2.姜黃素

7、能顯著抑制脊髓損傷8周后膠質(zhì)瘢痕形成;
　　3.姜黃素能抑制膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)GFAP和細胞外CSPG成分;
　　4.姜黃素能抑制膠質(zhì)瘢痕中炎癥因子表達。
　　結(jié)論:
　　姜黃素能促進脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。姜黃素通過抗炎作用抑制膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)成分GFAP表達。姜黃素通過抑制轉(zhuǎn)錄因子減少膠質(zhì)瘢痕細胞外成分CSPG表達。聯(lián)合抑制細胞內(nèi)外成分是姜黃素發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘢痕形成的作用機制。
　　二.姜黃素對星形膠質(zhì)細胞

8、的作用及機制
　　目的:
　　通過在體和離體實驗，探討姜黃素干預(yù)下星形膠質(zhì)細胞在炎癥反應(yīng)與纖維化過程中表型的轉(zhuǎn)變以及其與膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)外成分GFAP和CSPG表達的相互關(guān)系。
　　方法:
　　1.使用SD大鼠建立脊髓損傷模型并給予300 mg/kg姜黃素連續(xù)干預(yù)7天，采用姜黃素溶劑DMSO作為對照;
　　2.通過體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，并使用siRNA干擾NF-κb亞基p65和SOX9基因，采用EMSA、

9、WB和PCR檢測干擾效率;
　　3.使用免疫熒光、WB和PCR檢測膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)成分GFAP表達和NF-κb信號通路的相互關(guān)系，ELISA檢測星形膠質(zhì)細胞中趨化因子表達情況，流式細胞技術(shù)檢測膠質(zhì)瘢痕中T淋巴細胞和巨噬細胞的數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.姜黃素能抑制NF-κb信號通路成分p-IKK-α、p-IKK-β、p-IκB-α和p65表達，上調(diào)NF-κb抑制性分子IκB-α表達，從而抑制星形膠質(zhì)細胞活化;
　　

10、2.姜黃素能通過調(diào)控NF-κb信號通路抑制星形膠質(zhì)細胞釋放趨化因子MCP-1、RANTES和CXCL10，
　　3.姜黃素能通過調(diào)控NF-κb信號通路減少膠質(zhì)瘢痕中T淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。
　　結(jié)論:
　　姜黃素通過干預(yù)NF-κb信號通路抑制星形膠質(zhì)細胞的活性，抑制其分泌趨化因子，從而減少膠質(zhì)瘢痕中巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤，減輕星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。姜黃素通過調(diào)控SOX9信號通路抑制星形膠質(zhì)細胞纖維化，減少細胞

11、外基質(zhì)成分CSPG沉積。姜黃素能通過聯(lián)合發(fā)揮抗炎抗纖維化作用，有效抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕細胞內(nèi)外成分，有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　三.姜黃素對小膠質(zhì)細胞的作用及機制
　　目的:
　　本研究使用核因子E2-轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2(Nrf2)基因敲除小鼠Nrf2(-/-)和野生型小鼠Nrf2(+/+)，建立脊髓損傷模型或LPS誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細胞，并給予不同濃度姜黃素干預(yù)后，探討了姜黃素在脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞活化中的作用及

12、其機制。
　　方法:
　　1.使用Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠，建立脊髓損傷模型，給予不同濃度姜黃素(100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg)連續(xù)干預(yù)7天;
　　2.采用WB檢測脊髓損傷后28天內(nèi)小膠質(zhì)細胞活性與Nrf2表達之間的關(guān)系;
　　3.體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞，LPS刺激后給予姜黃素或ERK抑制劑U0126干預(yù)。
　　結(jié)果:
　　1.脊髓損傷后Nrf2和iNOS表達即可

13、升高，并于傷后第7天時達到峰值;
　　2.在體實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素干預(yù)后能促使小膠質(zhì)細胞中Nrf2由胞漿轉(zhuǎn)運到胞核中，抑制iNOS表達，抑制小膠質(zhì)細胞活性，且存在濃度依賴性，Nrf2基因敲除后廢除了姜黃素對小膠質(zhì)細胞的抑制作用;
　　3.離體實驗顯示，姜黃素干預(yù)Nrf2(+/+)小膠質(zhì)細胞后，p-ERK和iNOS表達均下降，而Nrf2(-/-)小膠質(zhì)細胞中p-ERK表達沒有改變。
　　結(jié)論:
　　姜黃素抑制脊髓損傷后小

14、膠質(zhì)細胞的活性，通過減輕小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。姜黃素抑制小膠質(zhì)細胞激活是通過調(diào)控Nrf2/ERK/p65通路實現(xiàn)的。
　　四.控制炎癥反應(yīng)后對神經(jīng)干細胞再生的影響及機制
　　目的:
　　神經(jīng)干細胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)具有自我增值及分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞的潛能，是神經(jīng)損傷后細胞替代療法的重要細胞來源。如何誘導(dǎo)NSPCs定向分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細

15、胞，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點和難點，也是熱點之一。本研究中我們通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞并誘導(dǎo)其分化為M1型和M2型，而后觀察各細胞上清誘導(dǎo)NSPCs分化情況，闡述不同表型的小膠質(zhì)細胞在NSPCs分化中的作用及其機制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞，給予不同干預(yù)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，采用免疫熒光、WB和PCR檢測M1和M2型小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物表達情況;
　　2.收集不同表型小膠質(zhì)細胞上清制成NSPCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

16、基并誘導(dǎo)NSPCs分化，采用免疫熒光和WB檢測神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分化比例;
　　3.采用液相色譜一質(zhì)譜分析和ELISA實驗檢測M2型小膠質(zhì)細胞PPARγ和15d-PGJ2表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.LPS+IFN-γ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型，IL-4誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型;
　　2.M2型小膠質(zhì)細胞上清誘導(dǎo)NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的比例升高，分化為星形膠質(zhì)細胞的比例減

17、少;
　　3.M2型小膠質(zhì)細胞中PPARγ和15d-PGJ2表達與M0和M1型相比較顯著升高。
　　結(jié)論:
　　M2型小膠質(zhì)細胞可以增加NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的比例，減少星形膠質(zhì)細胞分化數(shù)量。M2型小膠質(zhì)細胞促進NSPCs分化是通過激活PPARγ/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
　　綜上結(jié)果表明，姜黃素能抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時還能抑制星形膠質(zhì)細胞纖維化。姜黃素通過聯(lián)合發(fā)